[发明专利]提高抗体表达量和改良糖基化水平的细胞培养方法有效
申请号: | 201210074420.5 | 申请日: | 2012-03-20 |
公开(公告)号: | CN103320388A | 公开(公告)日: | 2013-09-25 |
发明(设计)人: | 蔡洁行;于颖佳;陈乘;张莉 | 申请(专利权)人: | 无锡药明康德生物技术有限公司 |
主分类号: | C12N5/10 | 分类号: | C12N5/10 |
代理公司: | 上海浦一知识产权代理有限公司 31211 | 代理人: | 高月红 |
地址: | 214092 江苏*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 提高 抗体 表达 改良 糖基化 水平 细胞培养 方法 | ||
技术领域
本发明涉及一种细胞培养方法,特别是涉及一种提高抗体表达量和改良糖基化水平的细胞培养方法。
背景技术
哺乳动物细胞培养生产抗体药物具有明显优势,主要是活性高、糖基化修饰正确,能够保证产品中二硫键等复杂蛋白结构的正确形成,因此,是最重要的表达系统。
糖链的结构和其中各种糖基的含量对单抗药物的药化药代特性以至药效有着重要的作用,如甘露糖的含量会影响单抗药物在体内的代谢速度。因此,糖基化水平是单抗药物的重要参数,而抗体的糖基化水平和糖基化修饰的类型直接影响抗体活性。
抗体(包括Fc融合蛋白)药物发挥靶向性消灭靶细胞(如肿瘤细胞)的重要作用方式(效应功能),主要有两种:ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)和CDC(complement dependent cytotoxicity,补体依赖的细胞毒性作用)。其中,ADCC是指表达IgGFc受体的NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等效应细胞,通过与已结合在病毒感染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合,而杀伤这些靶细胞的作用,其中,岩藻糖的含量影响抗体依赖细胞介导毒理反应。CDC是通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合,形成复合物而激活补体经典途径,所形成的攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。ADCC是由抗体与FcγR相互作用介导的,CDC则通过细胞外结合的抗体与启动补体效应的蛋白相互作用造成的。因此,ADCC和CDC这两种作用机制是抗体药物研发的体外研究、评价、筛选的重要指标,并且都与糖基化修饰水平和类型具有直接关系。
目前,针对ADCC和CDC抗体效应功能的抗体工程主要集中在对Fc的改造上,以增强抗体与FcγR的相互作用,最终增加效应功能。全长型抗体有两个N糖基化位点,它们介导了Fc与FcγR结合诱发的ADCC效应,进而也诱导了FcγR相连的细胞,活化了细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T-lymphocyte,CTL)的应答反应。通过基因突变和糖基异构的方法,优化Fc和FcγRs相互作用,能增强抗体抑制肿瘤的作用。IgG 297Asn的糖基化构成了寡聚糖连接中心,与其连接的岩藻糖能连接多种单糖,岩藻糖部分缺失能显著增强抗体与FcγRIII的结合能力及继发的ADCC效应。运用RNA干扰技术,在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中下调IgG糖基化关键酶-岩藻糖基转移酶8的表达,使抗体去岩藻糖化,结果该抗体的ADCC效应增强了100倍,该CHO的表达特性还可以遗传至子代细胞。此外,完整的人源IgG1与FcγR结合的氨基酸序列图谱的成功解析,有助于研制各种IgG1突变体,以提高它们与FcγR结合的能力。这些突变体甚至能与低亲和力的FcγRIIIA高效结合,并使ADCC效应增强。
我国目前的抗体现状与国际水平相比还有一定差距,主要表现是抗体表达量低,产品糖基化水平与标准品不吻合,进而导致抗体产品活性不理想或者毒副作用大等;虽然有些抗体表达量已经得到很大的提高,但是抗体的糖基化修饰一直没有很好的解决,并导致了抗体活性较低,从而限制了我国抗体药产业化的发展。如目前生物仿制药的研究热点,大都是上世纪90年代左右在欧美上市的单抗药物。生物仿制药的质量水平是否与原药一致,是毒理研究和临床实验的先决条件,也是审批的关键,即要求该生物仿制药的各项质量参数能达到与原产品一致或相似,才能保证同水平的药效。
然而,现阶段,国内还没有有效的调整糖基化水平的方法,如通过改变细胞培养工艺来调整岩藻糖含量的方法,来提高抗体药物的表达量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高抗体表达量和改良糖基化水平的细胞培养方法。针对现有哺乳动物细胞培养工艺的缺点,本发明建立的细胞培养方法,能改善糖基化修饰类型,进而提高抗体活性、降低抗体毒副作用;同时,能改变抗体活性高而抗体表达量低的缺点,是一种抗体高表达、高活性的细胞培养方法。
为解决上述技术问题,本发明的提高抗体表达量和改良糖基化水平的细胞培养方法,包括:通过优化的表达抗体的细胞株的基础培养基和补料批次方法,进行表达抗体的细胞株的培养,从而提高抗体表达量和改善抗体的糖基化水平;
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