[发明专利]（1－3）－β－D－葡聚糖的精制方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种（1－3）－β－D－葡聚糖的精制方法。

背景技术

侵袭性真菌感染越来越受到临床医生的重视，在肿瘤化疗、骨髓/器官移植、AIDS和危重病等免疫功能受损的患者中，其患病率和死亡率明显上升。广谱抗生素和有创性诊疗操作是导致侵袭性真菌感染发生的主要危险因素。由于侵袭性真菌感染缺乏特异性临床表现，传统实验室涂片、培养等微生物学检查耗时且阳性率低，组织病理学检查因有创伤加重患者病情而严重限制了临床应用，这些复杂的因素使受侵袭性真菌感染的诊断极其困难和滞后，也是死亡率增高的重要原因。真菌感染患者血浆中含有（1－3）－β－D－葡聚糖是目前关注较多的一种诊断方法，（1－3）－β－D－葡聚糖仅存在于真菌的细胞壁中，细菌和人类细胞壁不存在（1－3）－β－D－葡聚糖，因此血浆（1－3）－β－D－葡聚糖阳性具有特异性诊断深部真菌感染的价值。

目前真菌葡聚糖检测采用的标准品为（1－3）－β－D－葡聚糖，现市贩的（1－3）－β－D－葡聚糖，纯度较低或者价格较昂贵。

发明内容

本发明的目的在于提供一种（1－3）－β－D－葡聚糖的精制方法，制备的（1－3）－β－D－葡聚糖纯度较高、成本较低。

本发明采取的技术方案如下：

（1）    脱脂：将茯苓粉末分别用无水乙醇、80%乙醇和水提取、过滤，滤渣经脱水、干燥得到脱脂茯苓；

（2）    粗制：脱脂茯苓用水配制成重量比为0.8%-1.2%的悬浮液，冷却至 0-4℃，边搅拌边加入5N NaOH溶解，然后4℃、10000rpm离心15-30min除去不溶物，上清液置于0-4℃冰水浴中边搅拌边加入体积比为10%的醋酸进行中和；4℃、10000rpm离心15-30min收集胶状沉淀；上述胶状沉淀依次用水、酒精、乙醚洗涤、脱水；然后放入硫酸干燥器进行减压干燥，得到粗制（1－3）－β－D－葡聚糖；

（3）    精制：取粗制（1－3）－β－D－葡聚糖加入二甲亚砜，在室温下搅拌溶解；4℃、10000rpm离心15-30min，除去沉淀；上清液边搅拌边缓慢加入0-4℃冰水，直至沉淀不再增加， 4℃、10000rpm离心15-30min收集沉淀，沉淀依次用水、酒精、乙醚洗涤、脱水，然后放入硫酸干燥器进行减压干燥，得到精制（1－3）－β－D－葡聚糖。

本发明的显著优点：目前，国内的多糖生产原料主要是真菌子实体发酵得到的菌丝体及发酵液等，本发明的原料直接采用子实体（茯苓子实体本身为块状，晒干后破碎研磨成粉末），则来源广泛且成本低；而工艺相比之下，热水浸提法较费时且收得率低，酶法及超声波法又易破坏多糖的空间结构及活性且成本较高，本工艺成本低，操作简单，收得率也较高，其产品纯度高，性能也较稳定。

附图说明

图1为Dextran-40的高效液相色谱图。

图2为精制BG的高效液相色谱图。

图3为 Dextran-40纯品的标准曲线。

图4为精制BG的标准曲线。

图5为在0--4℃冰箱保存7天后的精制BG的标准曲线。

具体实施方式

实施例1

（一）脱脂

①原料、试剂及器具的准备

②取茯苓粉末500g放入3L的烧杯中，加入2L酒精，用锡箔纸覆盖，室温下搅拌30min。然后用63目的砂芯漏斗进行抽滤。

③以上②的操作重复两次。

④滤取的茯苓粉末加入80%酒精，用磁力搅拌器搅拌30min（室温）。

⑤用G3砂芯漏斗抽滤。

⑥按④⑤的操作重复两次。

⑦滤取的茯苓粉末加入4L水用磁力搅拌器搅拌30min。

⑧用G3砂芯漏斗抽滤。

⑨按⑦⑧的操作重复两次。

⑩将得到的茯苓粉末放入G3砂芯漏斗，用药勺一边搅拌，一边加入酒精脱水，

之后用40℃真空干燥，这样500g茯苓能得到400g脱脂茯苓。

（二）粗制（1-3）-β-glucan(BG)

①    取脱脂茯苓12g放入2L三角烧瓶，加水1080ml，用磁力搅拌器搅拌，使其分散，呈悬浮状。

②    在冷却条件下（0-4℃），边搅拌边加入5N NaOH 120ml，溶解。

③    移入离心管，4℃ 、10000rpm 、20min，离心除去少量不溶物。

④    将上清液倒入2L烧杯，置于冰水浴（0-4℃）中边搅拌边加入10%醋酸，使溶液中和。