[发明专利]一种草鱼白细胞介素10酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明属于酶联免疫检测(ELISA)生物技术领域，具体涉及一种草鱼白细胞介素10竞争抑制酶联免疫检测方法。

背景技术

白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)是一种重要的细胞因子。1989年Fiorentino等发现小鼠Th2细胞能分泌一种抑制Thl细胞分泌干扰素等细胞因子的物质，因此将这种物质命名为细胞因子分泌抑制因子(cytokine synthesis inhibiting factor，CSIF)，后称为白细胞介素10。随后的研究发现，该细胞因子对炎症、恶性肿瘤、自身免疫性疾病起重要作用。它能抑制T细胞、巨噬细胞的增值分化，同时也能促进B细胞的稳定分化，它的免疫多样性使其在免疫系统中发挥着重要的作用。目前的研究还表明，白细胞介素10对于炎症性动物有免疫调节功能和可能的治疗作用。

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，俗称有：鲩、油鲩、草鲩、白鲩、草鱼、草根(东北)、混子、黑青鱼等。英文名：Grass carp。因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的四大家鱼之一，具有重要的经济价值。但草鱼抗病力和成活率较低，易患出血病、烂鳃病、赤皮病和肠炎病等，加之高密度养殖增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会，使病害日益加剧，因此研究草鱼免疫系统的各类免疫反应及其机制十分必要。白细胞介素10在鱼类免疫反应中具有广泛生物学活性，对免疫系统的调控发挥着必不可少的作用，因此检测草鱼中IL-10的分泌状况不仅有利于了解草鱼免疫调节机制，而且为开展该鱼类的疾病防治提供有用信息。但是，目前鱼类IL-10的分泌检测方法并没建立，主要因为硬骨鱼IL-10与哺乳动物、两栖动物的IL-10两栖动物的IL-10分子结构差异较大，不能用其他种族的IL-10抗原及其抗体代替分析检测硬骨鱼IL-10。同时鱼类IL-10抗体的缺乏使对IL-10的分泌检测和功能的精细鉴定陷入瓶颈。本研究通过重组蛋白草鱼IL-10制备多克隆抗体，并成功建立IL-10的ELISA检测系统，为检测IL-10的分泌及阐明其功能地位提供了基础方法。

发明内容

本发明的目的是建立草鱼白细胞介素10ELISA检测方法，可用于草鱼IL-10蛋白表达水平的检测，由于采用多克隆抗体，费用较低且具有良好的稳定性和重复性，检测限为0.1-100ng/mL。

为了实现上述目的，本发明利用重组表达的草鱼白细胞介素10作为免疫原免疫健康白兔得到多克隆抗体，再用辣根过氧化物酶(HRP)标记该多克隆抗体，最后用重组草鱼白细胞介素10蛋白和HRP标记的多克隆抗体建立竞争抑制酶联免疫检测方法。

上述技术方案包括以下步骤：

1)抗原蛋白的制备

将草鱼IL-10cDNA序列克隆到原核表达载体pET-30a(+)中，构建重组原核表达载体，并将此载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达(周红、韦鹤、汪新艳，一种草鱼白细胞介素10基因和蛋白及其重组表达方法，中国专利申请号：201110096027.1)。所得重组蛋白即为抗原蛋白。

2)草鱼白细胞介素10多克隆抗体的制备

以重组草鱼白细胞介素10蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔并利用多克隆抗体制备与纯化技术获得草鱼白细胞介素10多克隆抗体，该抗体可与草鱼白细胞介素10特异的结合。

3)草鱼白细胞介素10多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记

采用马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶试剂盒(购自Thermo Scientific公司)标记草鱼IL-10多克隆抗体。

4)ELISA操作方法

(1)经过棋盘滴定法确定ELISA检测时辣根过氧化物酶标记的草鱼白细胞介素10多克隆抗体的最适稀释倍数为1∶2000，包被抗原的浓度为2μg/mL，每孔100μL。

(2)包被：以0.05M的碳酸盐缓冲液稀释草鱼白介素10重组蛋白至2μg/mL，以此作为包被原加入酶标板中，每孔100μl，4℃孵育过夜后甩干孔内液体，并用PBST洗涤三次，每次300μl/孔，3分钟每次。

(3)封闭：用封闭液(PBS稀释的5％脱脂奶粉、0.3％BSA溶液)室温封闭两小时，300μl/孔。