[发明专利]基于Taqman探针的水产品中麦氏弧菌的荧光定量PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于Taqman探针的水产品中麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)的荧光定量PCR快速检测方法。

背景技术

麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)是革兰氏阴性菌，短小稍弯曲的弧状菌，无芽孢、无荚膜，有偏端单鞭毛一根，运动方式呈直线穿梭样，嗜盐菌，TCBS(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium)平板上生长，菌落呈黄色。麦氏弧菌是一种致病性弧菌，广泛存在于河流、海湾和下水道中。麦氏弧菌被国内外学者公认为11种致病性弧菌之一，能够引起腹泻、创伤性感染和败血症。在饮用水中与腹泻病之间存在着密切的联系。

现有麦氏弧菌的检测方法主要有传统常规分离鉴定法、普通PCR检测法、ATB细菌鉴定法等。

基于Taqman探针的荧光定量PCR技术通过TaqMan探针与模板的特异性杂交来鉴别模板，具有很高的准确性，假阳性低，特异性好。目前尚未见用TaqMan探针快速检测水产品中麦氏弧菌的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测速度快、灵敏度高的快速检测水产品中麦氏弧菌的基于Taqman探针的荧光定量PCR方法。

研究表明：麦氏弧菌携带的rpoB基因是RNA聚合酶β亚单位编码基因，具有较高的保守性。本发明根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)网站上公布的麦氏弧菌rpoB基因全序列，以该特异基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，并且采用荧光定量PCR快速技术检测麦氏弧菌，具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。可以作为水产品中麦氏弧菌的快速、简便、准确的检测方法。

本发明的技术解决方案是：一种快速检测麦氏弧菌的方法，其特征在于有如下步骤：

(1)首先提取待检样品TCBS平板上可疑菌落的基因组DNA。

(2)荧光定量PCR反应液(25μL体系)：

其中包括提取的基因组DNA，2μL；10×PCR buffer，2.5μL；Mg²⁺，2mmol/L；Taq酶2U；UNG酶1U；dNTP 0.2mmol/L；麦氏弧菌特异性引物10pmol；TaqMan探针5pmol，最后加灭菌去离子水至25μL。

(3)荧光定量PCR仪程序参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，同时收集FAM荧光，72℃延伸30s，40个循环。

其中麦氏弧菌特异性引物为：

上游引物Vmetschnikovii-1：5′-GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC-3′

下游引物Vmetschnikovii-2：5′-CCAAGATGGTCGATATCATC-3′

特异性TaqMan探针为：

Vmetschnikovii-3：5′-CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3′

荧光定量PCR反应结束后，麦氏弧菌能形成典型的S型扩增曲线，而且Ct值＜35。

本发明提供了扩增麦氏弧菌的特异性引物Vmetschnikovii-1、Vmetschnikovii-2和TaqMan探针Vmetschnikovii-3，从而提供了一种快速检测麦氏弧菌的方法，同现有检测技术相比具有如下优势：

快速性：没有后处理，不用电泳、拍照，实时缩短了反应时间。

灵敏度高：光谱技术和计算机技术的联合使用，极大提高了检测的灵敏度。

特异性强：荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，二者缺一不可，故不存在非特异性扩增现象。

有效解决PCR污染：整个过程均在单管中进行，且勿需打开管盖，避免了PCR产物对实验室的污染。

具体实施方式

首先无菌操作取25g待测水产品，充分剪碎，放入盛有225mL灭菌海水的灭菌容器中，进行10倍梯度稀释后，选择2～3个适当稀释度，各以0.1mL涂布到TCBS平板上，在36℃±1℃培养箱中，倒置培养24h±3h。挑取5个可疑菌落提取基因组DNA并稀释备用。如果平板上的可疑菌落少于5个，则应该全部挑取进行基因组DNA提取并稀释备用。