[发明专利]一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片及方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因芯片，尤其涉及一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片及使用该复合基因芯片进行检测的方法。

【背景技术】

生物毒素(biotoxin)亦称天然毒素(natural toxin)，是指生物来源不可自主复制的有毒化学物质，包括动物毒素、植物毒素和微生物毒素等。其中微生物毒素主要由产毒微生物生长过程中分泌以及死亡后体内的物质释放而产生的，可以分为细菌毒素(bacterial toxin)和真菌毒素(mycotoxin)。常见的细菌毒素有金黄色葡萄球菌毒素、产肠毒素大肠杆菌肠毒素、志贺样毒素、志贺菌毒素、霍乱毒素、溶血毒素等。常见真菌毒素有黄曲霉毒素、伏马菌素等。对于上述诸多微生物毒素快速、准确的检测是有效预防中毒事件发生的前提和关键。但目前由于天然食物生产的全球化、新食品生产工艺的应用、人们饮食习惯的改变等各种因素在一定程度上增加了产毒微生物感染的途径，造成各种产毒微生物引起大规模中毒事件屡屡发生，以产毒微生物为根源的中毒占食物中毒事件之首位，其毒性之高仍是化学合成毒物都难以达到的。因此发展产毒微生物的快速检测、鉴定方法一直为国际上研究的热点。

目前国内外对细菌毒素和真菌毒素的直接检测存在一定的难度。主要的方法有：①生物法：有很大局限性，只能测出其毒性大小，无法确知其组成；所测得的毒性和小鼠的品系、状态、体重等有关，不确定因素很多很复杂；毒性测定结果重复性差；测试所需时间长，需专门人员，费用高。②基于免疫技术的免疫层析法、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹等。随着单克隆抗体和多克隆抗体制备技术的发展，免疫学检测地敏感性及特异性均有提高，但仍存在一定的问题。免疫学检测不可避免地可能发生交叉反应，使用的化学试剂也可能掩盖毒素的存在，实验受试剂纯度的影响很大，引起假阳性或假阴性。此外，与仪器测定相比免疫方法的检测灵敏度不高，只能作为快速筛选，常常需要检测限较低的仪器作结果确证。③基于仪器测定的薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(HPLC-MS)、免疫亲和柱-荧光检测(IAC-FLD)。仪器测定有灵敏度高、检测限低、自动化程度高的优点。然而此方法所需仪器昂贵，人员技术要求高，标准品毒性大，一些毒素标准品难以获得。另外，现时的仪器和技术尚未能实现同步检测多种毒素及其衍生物。④基于核酸和基因探针技术的PCR反应(Polymerase Chain Reaction，)和实时荧光PCR法(Real-Time PCR)等。基因芯片(gene chip)又称DNA芯片，是20世纪90年代发展起来的一项专门用于核酸检测的前沿生物技术，是在分子杂交技术和微晶技术(microfabrication technology)的基础上发展起来的生物高技术，具有传统的检测方法不可比拟的优点：微型化、高通量、并行处理、快速分析、高准确性、高灵敏度、定量分析等。能够对污染食品的产毒细菌、真菌的毒力基因实现快速的在线检测，及时反映食品中存在的潜在毒素污染问题。基因芯片技术是将待测样品DNA或RNA通过PCR扩增、RT-PCR扩增、体外转录等技术渗入探针分子后，与位于芯片上的探针分子杂交。通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号强度。计算机软件进行数据的比较和综合分析后，即获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息。由于微生物毒素种类众多，且存在许多结构相似的衍生化合物，因此现有方法分别在特异性、灵敏度、适用范围、检测成本等方面有较大局限性。基因芯片具备高通量的优点，通过反向杂交技术，可同时高通量、并行分析处理多基因、多序列，从而对多种产毒微生物进行同步检测鉴定。

【发明内容】

本发明要解决的一个技术问题是提供一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片，同时检测14种常见致病菌，检测通量高、特异性强、灵敏度好、快速有效。

上述技术问题通过以下技术方案解决：

一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片，其特征在于，所述复合基因芯片上整合了如下探针：

用于检测金黄色葡萄球菌的靶基因FemA的探针：

金黄色葡萄球菌1探针，其序列为GCT CAC TAT TTG CTT GGC TTT G，

金黄色葡萄球菌2探针，其序列为TTT GAC TCT CAT TCAAAT GTT G；

用于检测沙门氏菌的靶基因invA的探针：

沙门氏菌探针，其序列为AAT AAG ACC GGC CTT CTA GG；