[发明专利]一种助阳离子扩散蛋白DbsCDF及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程，和生物修复领域。具体地说，本发明提供了生活在酸性矿山废水(acid mining drainage，AMD)的一种未知微生物所含有的一种对重金属镉抗性的基因即助阳离子扩散蛋白基因(DbsCDF)的序列，以及该序列推测编码蛋白质分子的氨基酸序列。本发明在提高微生物和植物对重金属镉的抗性方面有着重大的应用价值。

背景技术

随着矿产资源的开发利用、工业发展，重金属对环境造成的污染日趋严重，土壤重金属污染已经成为一个危害全球环境质量的问题。土壤重金属会影响植物的生长发育，降低农作物的产量和质量，带来了严重的经济损失。此外，受土壤重金属污染的作物在植物体中积累，并通过食物链富集到人体和动物体中，危害人畜健康，引发癌症和其他疾病等。治理重金属污染刻不容缓，各种修复技术和措施正在研究和应用中。各国政府和科学家着力通过两个途径解决这一问题：一为利用物理的，化学的方法试图清除土壤或水体的重金属污染：二为利用现代生物技术清除污染。自从20世纪80年代以来，生物修复技术因其具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到广大科技人员的广泛关注。生物修复一般分为植物修复、动物修复和微生物修复三种类型，其中植物修复和微生物修复是研究的热点。微生物修复就是利用微生物将环境中的污染物降解或转化为其他无害物质的过程。近年来，基于微生物对重金属的作用机理，以修复有毒有害金属污染或回收有经济价值重金属为目的的生物处理技术日趋成熟。植物修复指利用植物去治理水体、土壤和底泥等介质中的污染的技术。然而用于重金属污染修复的生物往往会受到重金属的毒害，生长缓慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金属对植物和微生物的毒害作用是生物修复的主要限制因素。

解决生物修复中重金属对生物的毒害作用的根本途径在于研究耐受重金属的分子生物学机制，克隆对重金属耐受的关键基因，通过基因工程手段获得用于生物修复中性能优良的转基因工程生物。

由于技术上的原因，直到最近，对微生物基因资源的利用主要局限于可培养微生物。然而，已培养微生物仅占自然界中微生物的不到1％，因此各种生境中的微生物宏基因组是一个巨大而未发掘的基因资源库。极端环境具有丰富的微生物资源，当中许多与逆境和关键生命过程相关的基因在长期的适应进化中获得了更强的耐性潜能，发掘这些抗性基因已成为国际重要的研究热点。酸性矿山废水(AMD)是极端生境微生物学研究的重要系统。AMD来源于采矿活动使含硫矿物(主要为黄铁矿，FeS₂)暴露于空气和水中，在微生物催化作用下迅速氧化产酸所致，其pH值一般在1-4左右，而且富含硫酸盐以及Pb、Zn、Cu、Cd和Ni等重金属，是采矿业面临的最严重环境问题之一。在AMD中生存的原核微生物在长期的进化过程中逐渐形成了一些独特机制，以应对低pH值、高盐度以及高重金属等多种极端环境协迫。因此，AMD生境成为极具特色和丰富的抗逆基因库。

助阳离子扩散蛋白(cation diffusion facilitator，CDF)家族具有耐重金属作用，存在于很多种生物体液泡膜上。非直接的证据显示：这些蛋白质具有运输作用，既可以将金属离子运输入细胞内，也可以将金属离子输出细胞。并且CDF蛋白质有助于多数生物体对Zn²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Ni²⁺的耐受性。不同来源的CDF家族蛋白质在结构上有着一些共性：N-端信号序列，6个跨膜区，C-端阳离子输出域，在大多数真核生物中，还存在胞内His富集域，而在原核生物中没有。在拟南芥中有8个基因编码的蛋白质属于CDF家族，4种具有上述结构特征，而其他几种(AMtTPc1～AtMTPc4)的结构略有不同：包含4-5个跨膜结构域，其中3种只具有部分N-端信号序列，并缺乏His富集域。拟南芥AtMtTP1的主要功能是提高细胞的金属耐性。有研究显示：AtMtTP1可以对Zn²⁺的毒害起解毒作用。如果在光滑爪蟾卵母细胞中表达AtMTP1，则可富集更多的Zn²⁺。此外，通过将有钩柱花草cDNA文库在啤酒酵母中的表达，鉴定出4种相关的CDF蛋白，其中ShMTP1对Mn²⁺有耐性。而Persuns等人从野生芥末中分离出TgMTPs基因，它编码的CDF蛋白可以恢复啤酒酵母COT1和ZRC1(酵母中对Zn²⁺和Co²⁺有耐性的CDF蛋白)突变体耐重金属的能力。