[发明专利]多重实时荧光PCR同时检测五种马铃薯病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种多重实时荧光PCR同时检测五种马铃薯病毒的方法。

背景技术

马铃薯是一种重要的世界性粮食作物，马铃薯病毒病是马铃薯上非常重要的一类病害，分布于世界各马铃薯种植区，其中一些马铃薯病毒会严重的影响马铃薯的产量和质量。在我国，主要的马铃薯病毒种类有马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)，马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)，马铃薯卷叶病毒(Potato virus，PLRV)，马铃薯A病毒(Potato virus，PVA)及马铃薯S病毒(Potato virus，PVS)。对生产影响最大的病毒是PVY和PLRV，其次是PVX和PVA，PVS影响较小。这些病毒严重影响马铃薯的产量及品质，一般减产10％～30％，重者达80％以上。除马铃薯外，茄科的其他作物如：番茄、青椒等也会被马铃薯病毒所侵染，马铃薯病毒检测及防治已引起极大重视，开发快速、灵敏、规范化的检测体系是病毒检测发展的必然方向。

目前国内外马铃薯分子检测技术的研究，多涉及以蛋白质为基础的检测(或血清学试验)方法和以核酸为基础的检测方法，较传统检测方法更为快速、灵敏、准确。因为马铃薯往往会被几种病毒同时侵染，所以多重检测在马铃薯病毒病防控中尤其重要。Singh等利用二重PCR方法同时检测了马铃薯中的PLRV和PVY。袁青等利用三重RT-PCR对感染PVX、PVS、PVA以及复合侵染的马铃薯叶片、叶梗、茎干和薯块进行测试，测试结果表明，该方法可检测出复合感染以上病毒的样品。

实时荧光定量PCR是近年发展起来的一种实时定量检测特定核酸技术，与普通PCR相比，具有定量准确、快速、灵敏度高、特异性强等特点，它已被广泛地应用于生命科学研究的各个领域。从原理上讲有两大类荧光模式：一类为荧光杂交探针，如Taqman、分子信标等，基于能量共振转移的原理(FRET)；另一类为DNA结合染料，主要为Sybr Green I。前面一种方法特异性好，除需要合成序列特异引物外，还需要合成高成本的荧光探针，成本较高；后一种方法经济，只需合成特异性引物，但易受引物二聚体的影响，特异性相对没有探针法高。

多重实时荧光PCR技术因具有高效快捷、能降低实验成本、加速实验进程等优点而得到广泛的认可。由于仪器的限制，利用探针法在一个反应体系里目前最多只能检测出四种扩增产物。Agindotan等利用Taqman探针同时检测出PLRV、PVA、PVX和PVY 4种病毒，但由于探针成本较高，探针法并不适合广泛应用。目前发展起来的多重实时荧光染料PCR技术可以在同一个反应体系中，通过Tm值分析来区分不同的核酸片段。王小武等利用SYBR Premix ExTaq同时检测出了猪生殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV-2)以及猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)3种病毒，Chassagne等利用Sybr Green在一个反应体系里可同时检测出大肠杆菌的stx1，stx2和eae这三种基因。

在多重实时荧光染料PCR病毒检测中，同时检测多种病毒，需要所设计的引物扩增条件一致，而扩增片段Tm值要能区分大小使其在一个熔解曲线中呈现出不同的峰。由于染料除了和目的片段也可以和引物二聚体结合而影响实验特异性，给引物设计增加了难度，而常用的Sybr Green I有“染料重分布”的缺陷对PCR扩增有抑制作用且对扩增产物存在偏爱性，在PCR扩增后熔解曲线分析中，要实现多扩增产物的熔解峰的区分往往是十分困难的。正因为上述种种限制，在一次检测中每增加一种病毒，在引物设计和扩增条件上就增加了一个级别的难度，这也是目前所报道的荧光染料多重PCR检测病毒最多还只能检测三种病毒的原因。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种多重实时荧光PCR同时检测五种马铃薯病毒的方法，该方法能能快速、可靠、灵敏度高、特异性强和价格便宜的同时检测马铃薯X病毒PVX、马铃薯Y病毒PVY、马铃薯卷叶病毒PLRV、马铃薯A病毒PVA以及马铃薯S病毒PVS这五种马铃薯病毒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种多重实时荧光PCR同时检测五种马铃薯病毒的方法，包括以下步骤：