[发明专利]一种啤酒中蛋白酶的定性检测方法

说明书

（一）所属技术领域

  本发明涉及一种啤酒中蛋白酶的定性检测方法，属于食品安全检测领域。 

（二）背景技术

啤酒中的蛋白酶来源于啤酒酵母。随着保存时间的延长，酵母会逐渐分解啤酒泡沫活性蛋白质，从而降低啤酒的泡沫稳定性。如何定性定量的测定啤酒酵母分泌的蛋白酶活性成为解决啤酒泡沫品质的关键点。

目前，检测蛋白酶的经典方法为Anson法，但此法存在灵敏度低，实验误差大，操作繁琐，耗时长等不足之处。Yokosawa用合成底物结合荧光分析的方法检测啤酒中的蛋白酶，但由于啤酒中含有氨基酸、类黑精等多种复杂物质，这些物质又具有光敏性，因而导致检测的空白值很高，直接影响了测定结果。此外，利用高效液相色谱（HPLC）也可以检测蛋白酶含量，该方法大大提高了蛋白酶检测的精确性，并减少了检测时间，但是由于实验费用高，限制了方法的实用性。

（三）发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种啤酒中蛋白酶的定性检测方法，是根据蛋白酶催化蛋白质水解的原理，用含有蛋白质、碳水化合物的脱脂奶粉（蛋白质含量50%~60%）作为底物。将待测样品定量地滴加在含有一定浓度固化底物的培养基上，在27~37℃温度条件下培养，观察小孔周围是否能形成透明圈，如果有，说明样品中含有蛋白酶；如果没有，则说明样品中不含有蛋白酶。

一种啤酒中蛋白酶的定性检测方法，包括以下步骤：

1、每100 mL去离子水或蒸馏水中加入1--2g脱脂奶粉和1-2g琼脂混合均匀配制成上层固化物；每100 mL去离子水或蒸馏水中加入1--2g琼脂混合均匀配制成下层固化物；将上述上层固化底物和下层固化物分别装入容器（装入量不可超过容器容积的2/3）、密封，116℃灭菌15min，45℃保温，以防止底物固化。 

2 、在一密闭容器底部事先垂直放置好可以形成孔洞（孔洞容积为0.1~0.5mL；孔洞高度为0.3-0.5 cm，是两层固化底物的厚度；孔洞间隔距离不小于1.5cm）的物体，该物体高度需大于0.3-0.5 cm，即需高于两层固化底物的厚度；密封，116℃灭菌15min。

3、将步骤1中灭菌后的下层固化底物及上层固化底物倒入步骤2所述的密闭容器中：先倒入下层琼脂固化物，待下层固化物凝固之后倒入上层固化底物。所述倒入的下层固化物及上层固化底物的厚度相等，均为0.15~0.25cm，下层固化物的目的是增加孔洞容积。待两层固化物凝固后，用灭菌的镊子将用于形成孔洞的物体夹出，避免破坏周围底物，保证孔洞中不能留有固化底物。此时固化底物上会留孔洞，以滴加样品使用。

4 、将待测啤酒样品滴加入步骤3形成的孔洞中，密封容器，以防止水分蒸发、避免杂菌污染。

5、 将上述密封容器于27~37℃温度环境中放置24~168h后取出，观察孔洞表面周围是否形成透明圈，若存在，则说明样品中含有蛋白酶；若没有，则说明样品中不含有蛋白酶。

所述步骤3-4需在无菌环境下操作。

所述脱脂奶粉中蛋白质含量为50%~60%。

该方法检测蛋白酶的灵敏度高，样品前处理简单，不需要专门的仪器设备，操作简单，且所用样品量少，培养环境要求低，实验所需成本低。基于以上优点本方法适合在实验室、啤酒企业广泛推广应用。

 

（四）具体实施方式：

实施例1：

反应体系组成：用100ml去离子水溶解2g琼脂融化、混合均匀作为下层固化物；

              用100ml去离子水溶解2g琼脂和2g脱脂奶粉融化、混合均匀作为上层固化底物；

牛津杯：10*7.8*6.0（mm）；

培养皿：Ф9cm玻璃培养皿；

步骤3-4需在无菌环境下操作。

实验操作方法如下：

1 将上层固化底物和下层固化物分别定量10mL分装入试管，116℃灭菌15min。

2 将灭菌的上层固化底物和下层固化物分两次倒入事先放置好2个牛津杯的培养皿中（牛津杯分隔2cm距离摆放），先倒入下层琼脂固化物，待其凝固之后倒入上层固化底物。下层固化物的目的是增加孔洞容积。待两层固化底物凝固后，用灭菌的镊子将牛津杯夹出，避免破坏周围底物；如果孔洞中留有底物，用灭菌后的牙签将其挑出，保证孔洞中空白。此时固化底物上会留有两个孔洞，以滴加样品使用。

3 将待测啤酒样品滴加入孔洞中。用封口膜封住培养皿，以防止水分蒸发、避免杂菌污染。