[发明专利]PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中I型马立克氏病病毒感染

说明书

本申请是申请日为2010年04月09日、申请号为201010142266.1、发明创造名称为“PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中病毒感染”申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中I型马立克氏病病毒感染，属于兽医微生物学领域分子生物技术。

背景技术

目前，在规模化养禽业和养猪业，病毒的多重感染是普遍性的问题，也是临床发病的真正原因。但是，对多种病毒的病原学检测对养殖场来说是一个困难问题。这是因为，很难对多个个体的不同病料同时做不同病毒的分离培养。现代分子生物学技术PCR和核酸探针斑点分子杂交技术有助于解决这一问题。在一切条件完美时，PCR的灵敏度非常高。但在实际应用时，常常出现假阳性和假阴性问题。如，有时PCR产生的DNA条带虽染大小与预期的一样，但测序结果表明，却是一种无关核酸。此外，由于技术性原因，PCR的可重复性也较差，特别是其灵敏度的可重复性较差，常常PCR产物在电泳时看不到核酸条带。这是因为，PCR产物电泳时，如果加入的DNA量小于50pg，则很难看到条带。用特异性核酸探针做斑点分子杂交，其特异性较稳定，其检测灵敏度可达1pg的同源核酸。但如果病毒感染量小时，在1μg病料样品的总DNA中，特异性病毒的核酸可能不足1pg，因而也检测不出来。如过将PCR和斑点杂交结合起来，则既能确定PCR产物的特异性，也能提高PCR产物的检出灵敏度。但如果再结合斑点杂交，则只要1pg就可显现阳性了。而且，电泳显示的条带，并不代表是特异的。

发明内容

本发明的目的是为克服PCR在实际应用时，常常出现假阳性和假阴性问题；用特异性核酸探针做斑点分子杂交，但如果病毒感染量小时，在1μg病料样品的总DNA中，特异性病毒的核酸可能不足1pg，因而也检测不出来这些不足，而将PCR和斑点杂交结合起来，则既能确定PCR产物的特异性，也能提高PCR产物的检出灵敏度。但如果再结合斑点杂交，则只要1pg就可显现阳性了。先将疑是病毒感染的肉鸡样品DNA用针对可疑病毒的特异性引物PCR扩增后，再对PCR的产物用该病毒的特异性核酸探针做斑点杂交，不仅能显示PCR产物的特异性，也大大提高了检出率。

A发明的详细描述

1本发明主要步骤

(1)病料的收集及样品DNA的制备

取因患病引起不同临床表现的动物、病死动物的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。按常规方法提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液制备成为样品DNA。

(2)扩增样品中可疑病毒的特异性核酸片段

设计可疑病毒特异性引物(F2/R2)扩增出样品DNA可疑病毒特异性核酸片段(样品PCR扩增的片段大小长于探针)，如图1所示。用于扩增样品的引物(F2/R2)序列必须在探针标记用引物(F1/R1)序列之外，即被标记探针DNA序列之外；其扩增的产物长于标记探针DNA序列。

(3)地高辛PCR法标记病毒核酸探针制备及特异性及敏感性的测定

利用已知病毒基因组DNA克隆用于标记病毒核酸探针。设计引物(F1/R1)采用地高辛PCR法标记技术，进行地高辛标记制备探针，将纯化的病毒的特异性DNA片段作为标记DNA探针的模板，探针标记方法按以上试剂盒操作说明书进行。

(4)各样品及其相应PCR产物用标记的病毒核酸探针进行斑点杂交检测。

2本发明的具体描述(以鸡贫血病病毒为例)

(1)病料的收集及样品DNA的制备

取疑似鸡贫血病病毒(CAV)感染引起不同鸡群临床表现的鸡、死鸡的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。对组织样品，各取0.02g研磨，加入0.5mL DNA抽提缓冲液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl，pH 8.0，0.25mmol/L EDTA，pH 8.0，0.5％SDS)和终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，55℃消化过夜。次日，按常规方法(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南第二版.科学出版社，1996)提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液(加适量核糖核酸酶)中，即为样品DNA。同时提取无特异性病原(SPF)鸡相应组织的DNA作阴性对照。

(2)样品DNA针对CAV的特异性核酸片段的扩增