[发明专利]一株链霉菌及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及链霉菌NK49及其用于生产具有抗菌活性的氨基酸均聚物ε-聚赖氨酸的用途和方法。 

背景技术：

ε-聚赖氨酸(ε-Poly-L-Lysine，ε-PL)是一种由25-30个L-赖氨酸单体通过ε-氨基和α-羧基脱水缩合形成的同型单体聚合物多肽，其结构式为： 

ε-聚赖氨酸常常由放线菌产生，对于革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌具有广谱的抑菌活性，并且能够承食品加工过程中的热处理，可随食品原料一同处理并加工。ε-聚赖氨酸已经被FDA批准可作为食品防腐。ε-聚赖氨酸安全性高、水溶性强、在人体内可分解为人体必需的氨基酸----赖氨酸，是一种营养型防腐剂。我国ε-聚赖氨酸的生产能力和水平较低，不能满足人们日益增长生活水平的需要。究其原因在于缺少ε-聚赖氨酸合成能力强的具有知识产权的微生物菌种。因此，开展微生物法合成ε-PL的研究，分离新的合成能力高的菌株，优化ε-聚赖氨酸发酵和分离与精制的方法，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一株具有较强ε-聚赖氨酸生产能力的链霉菌Streptomyces sp.NK49。 

本发明用于生产ε-聚赖氨酸的链霉菌NK49，分离自辽宁省沈阳地区地的 农田土壤。 

菌株的16SrDNA序列分析：利用16SrDNA通用引物，得到16SrDNA序列长度为1491bp；其16SrDNA序列在GenBank中进行同源性比对后发现，该菌株与链霉菌属具有100％同源性，结果显示该菌株属于链霉菌属，命名为链霉菌Streptomyces sp.。 

链霉菌Streptomyces sp.NK49的形态特征为：在贝纳特斜面上生长时初期呈凸起装半球形白色菌落，形成的菌丝将菌落牢牢固定在培养基上，不易挑起，菌落生长初期呈白色，且具有放射状褶皱，后期孢子逐渐成熟，菌落表面被灰黑色孢子覆盖。菌体光镜下呈丝状，分生孢子丝呈螺旋状，孢子椭圆形。 

该菌株于2012年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为：CGMCC No：5932。 

链霉菌Streptomyces sp.NK49发酵培养特征为：在利用碳水化合物进行发酵过程中会产酸。 

菌种的保藏条件为将孢子利用脱脂牛奶保护后真空干燥长期保藏，或制备砂土管对孢子进行保藏；该菌平时保藏于贝纳特斜面上，便于直接应用。 

本发明的第二个目的是提供链霉菌Streptomyces sp.NK49用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法。 

为实现这一目的，本发明采取以下技术方案和操作步骤： 

(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK49，挑取一环孢子接种在高氏一号培养基中作为种子进行活化培养20-36h； 

(2)将种子液以5-15％的接种量接种至以淀粉水解糖或淀粉水解糖与甘油为碳源的合成培养基中，摇瓶发酵培养48-96h； 

(3)发酵结束后，发酵液6000～10000rpm离心处理10～20min去除菌体，收集上清，利用5M NaOH溶液将上清调整pH至8，过滤祛除沉淀的杂蛋白； 

(4)利用弱酸型阳离子交换树脂吸附去除了杂蛋白的上清液中的ε-聚赖氨酸分子，蒸馏水洗涤；利用0.1-0.7mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用5M NaOH溶液将pH调整到中性； 

(5)将中性的洗脱液进行透析，去除小分子杂质，冷冻干燥，得到ε-聚赖氨酸固体粉末； 

(6)利用HPLC对产物水解液进行测定，利用¹HNMR和¹³CNMR对产物进行结构分析，利用MODI-TOF MS对产物聚合度和分子量进行测定。 

与现有ε-聚赖氨酸生产菌株相比较，本菌株合成聚赖氨酸能力较强、生长 周期较短，且能利用淀粉糖或其水解糖，具有规模进一步利用的潜力。赖氨酸产品的潜力。 

具体实施方式：

在下面的实施例中所用菌种均为链霉菌Streptomyces sp.NK49，实施例中所用各种培养基及溶液、试剂配方如下： 

(1)土壤稀释液(/L)：NaH₂PO₄·2H₂O 12.17g，蛋白胨60g，SDS 0.5g；