[发明专利]指导华法林使用起始剂量快速基因分型的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种能实现指导华法林使用起始剂量快速基因分型的方法，具体说是通过抽取人外周血DNA，通过PCR扩增后再进行高分辨率熔解曲线分析，对CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)两个多态性位点进行快速基因分型。该方法可以用于临床需要服用华法林的各类患者的辅助诊断、治疗，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。 

背景技术

华法林是目前广泛应用的香豆素类口服抗凝药，用于预防和治疗血栓栓塞性疾病如：人工瓣膜置换、静脉血栓形成(肺栓塞)、房颤等的口服抗凝治疗，以及降低心肌梗死复发及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危险。但是华法林的剂量很难掌握，因为不同病人的所需用量可以相差十倍以上。目前，CYP2C9和维生素K环氧化物还原酶(VKOR)基因多态性对华法林代谢的影响逐渐被认识，其中CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)与华法林关系最为密切，都与代谢酶的损伤有关，从而导致个体间和民族间华法林用量的差异。因此，临床上一种快速准确的基因分型方法的应用将对需华法林治疗的患者提供个体化的医疗方案。 

现在已经证实有30多种基因相互作用决定华法林代谢、转运和药理作用。患者不同的药物基因组学信息是导致华法林剂量差异的重要因素。与遗传因素相关的低凝血酶原患者最常见的原因是CYP2C9代谢活性降低和药物靶标VKORC1(vitamin K epoxide reductase complex 1)低表达。这两种基因的遗传多态性在全世界范围内可解释15％和25％的华法林剂量变异。因此美国FDA在2007年修改了华法林的使用说明，建议在使用华法林前进行基因分型。而且CYP2C9、VKORC1基因多态性分析已经成为国内外有条件的临床实验室重要检测项目。 

目前检测CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)遗传多态性的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。探针法操作过程简单，PCR扩增的特异性高但订购探针的成本太高，并且探针在反复冻融后容易失效，临床应用的可行性低。DNA测序法虽然是目前进行基因诊断的金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承受范围。因此，急需要寻找简单易行的基因分型方法。 

通过实验我们证实了高分辨率熔解曲线的方法是一种快速，简便，经济，实用的分型方法，并且我们通过对其敏感性和特异性的检测发现均在98％以上，结果可靠性高。有望在临床快速基因分型中得到广泛的应用。 

发明内容

本发明要解决的首要技术问题是提供一种能指导华法林使用起始剂量快速基因分型的方法。 

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种能指导华法林使用起始剂量快速基因分型的试剂盒。 

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 

一种能指导华法林使用起始剂量快速基因分型的方法，该方法通过提取人的外周血白细胞基因组DNA，采用快速准确的基因分型方法测定受试者的CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)两个位点的基因型。 

一组能指导华法林使用起始剂量快速基因分型的引物和高分辨率熔解曲线，能特异性的扩增出CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)位点的扩增产物，随着温度逐渐升高，使扩增产物的DNA解链，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，通过检测荧光信号随温度的变化即可得到扩增产物的熔解曲线，根据熔解曲线的形状从而可以判断是否存在突变位点以及突变位点的基因型。 

具有序列表SEQ ID 2和5所示的碱基序列：其中SEQ ID 2和3所示序列为CYP2C9*3(1061 A/C)位点F和R引物序列，SEQ ID 4和5所示序列为VKORC1(-1639 G/A)位点F和R引物序列。 

一种能指导华法林使用起始剂量快速基因分型的试剂盒(10人份)，由以下试剂组成：