[发明专利]高催化活力脂肪酶突变体

说明书

本申请是原申请号200910235185.3的分案申请，申请日2009.11.11，发明名称“通过定向进化构建的活力提高的脂肪酶突变体”。

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体地说涉及酶活力提高的华根霉脂肪酶突变体。

背景技术

脂肪酶（EC 3.1.1.3）不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯化、酸解等反应，被广泛地应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。微生物是脂肪酶的一个重要来源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今，已有超过30种根霉脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶大都具有高度1,3-位置选择性，因此常用于油脂加工中。此外，根霉脂肪酶还具有稳定性佳，转化效率高等优点，被广泛应用于芳香酯、生物柴油、手性化合物的生产中。

目前为止，国内外已报道了多个根霉脂肪酶的基因序列。日本、德国对米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase, ROL）的基因序列和表达做了比较深入的研究，并先后用大肠杆菌、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母成功表达了脂肪酶基因（Minning S et al. J Biotechnol, 1998, 66 : 147-156; Beer HD et al. Biochim Biophys Acta, 1998, 1399 : 173-180; Ueda M et al. J Mol Catal B: Enzym, 2002, 17 : 113-124）。发明人在前期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶的华根霉（Rhizopus chinensis CCTCC M 201021）菌株，并从该菌株中克隆得到脂肪酶基因序列(Genbank登录号EF405962)，并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高水平分泌表达（Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B: Enzym, 2009, 57:304-311）。

定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的基因，通过改进的诱变技术改造的酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的天然酶。近10年来，定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得巨大的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面（Johannes TW et al. Curr. Opin. Microbiol, 2006, 9: 261-267）。 

酶活力的提高可以用酶的动力学参数K_cat值来表示。K_cat又称转化数，指每分子酶或每个酶活性中心在单位时间内能催化的底物分子数(TN)，也称为催化常数。因此，K_cat值的提高即代表了酶活的提高。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供酶活力提高的华根霉脂肪酶。

本发明的技术方案：通过定向进化构建的活力提高的脂肪酶突变体，由华根霉（Rhizopus chinensis）CCTCC M 201021脂肪酶基因(Genbank登录号EF405962)，运用易错PCR方法，通过多轮重组和定点突变，经定向进化而获得的脂肪酶突变体，在突变体的氨基酸序列中，包含氨基酸突变Ala129Ser、Lys161Arg、Thr195Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、Lys322Arg、Ser373Asn以及上述氨基酸两个、三个或四个突变的组合；以转换数K_cat表示，脂肪酶突变体的酶活较出发菌株得到了提高；突变体的测序结果及其K_cat提高的倍数为：