[发明专利]肺炎链球菌3型多糖的纯化

说明书

本申请是申请号为200780037800.9、标题为″肺炎链球菌3型多糖的纯化″、申请日为2007年10月9日的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明关于减少或去除含血清3型多糖的复杂细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的改进方法，所述方法涉及加热或pH调节步骤。

背景技术

在制备用于预防由有机体的肺炎链球菌(也称为肺炎球菌)造成的侵入性疾病的多价肺炎球菌结合疫苗中，使选定肺炎链球菌血清型生长以供应制备疫苗所需的多糖。细胞是在大发酵罐中生长，同时在发酵结束时通过添加脱氧胆酸钠(DOC)或替代溶胞剂来引发溶胞。然后收集溶胞产物培养液用于下游纯化并回收围绕着细菌细胞的荚膜多糖。与载体蛋白结合后，多糖包含在最终疫苗产物中并赋予疫苗的目标种群对选定肺炎链球菌血清型的免疫性。

尽管以此工艺产生的细胞溶胞产物包含目标多糖，但其还包含大量细胞碎片，其包括DNA、RNA、蛋白质和残余培养基组份。传统的处理涉及通过添加乙酸来使溶胞产物的最低限度pH值降低到6.6以帮助溶胞剂和一些杂质沉淀出。将此物质进行离心，随后过滤以去除标称尺寸大于0.45μm的大部分固体。然而，所述传统的处理方法展示最低程度的杂质去除，同时随后难以去除可溶蛋白以符合纯化多糖规定。

在针对某些血清型的试验中，高含量的污染可溶蛋白尤其成问题。一些血清型、尤其肺炎链球菌3型产生大且粘的多糖链(例如，对于3型而言，2-3百万道尔顿(Dalton)的葡萄糖/葡萄糖醛酸的链)，当细胞溶胞时这些多糖链释放于生长培养基中。其粘性使其在离心后难以过滤，且在所述情况中，通过纯化工艺已不足以去除蛋白质且导致试验失败。

因此，需要用于自复杂细胞肺炎链球菌溶胞产物、尤其含肺炎链球菌3型多糖的溶胞产物去除蛋白质杂质的改良方法。

发明内容

提供减少或去除含血清3型多糖的复杂细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的改进方法。在一种方法中，将含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物在一定温度下加热一定时间以足以使溶胞产物中存在的蛋白质变性并使其聚集和沉淀。因此，在本发明的一个实施例中，所述方法包含以下步骤：1)将溶胞产物加热到至少60℃并保持至少30分钟以使蛋白质聚集和沉淀；及2)从溶胞产物中分离出沉淀物；其中产生实质上纯的含血清3型多糖的溶胞产物。在特定实施例中，将溶胞产物加热到约60℃至约70℃并保持约30分钟至约50分钟。在另一特定实施例中，将溶胞产物加热到约65℃并保持约40分钟。在其它实施例中，分离步骤包含使用膜过滤器、尤其0.45μm孔径膜过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。在另一实施例中，分离步骤包含使用深度过滤器来过滤溶胞产物以去除沉淀物。在另一特定实施例中，从溶胞产物中分离出沉淀物的步骤包含使溶胞产物离心以去除沉淀物。

在本发明另一实施例中，提供一种用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含涉及溶胞产物或分离物的pH调节的步骤。在此实施例中，pH调节步骤提高过滤性。在特定实施例中，使溶胞产物或分离物的pH值在过滤之前增加到至少8.0、特定而言在过滤之前增加到约8.0至约8.4之间、且更具体地在过滤之前增加到约8.2。在其它实施例中，过滤步骤包含使用膜过滤器、尤其0.45μm孔径膜过滤器过滤溶胞产物或分离物。在另一实施例中，过滤步骤包含使用深度过滤器过滤溶胞产物或分离物。

在本发明另一实施例中，提供减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含将溶胞产物加热步骤与涉溶胞产物或通过溶胞产物离心所产生的分离物的pH调节的步骤组合。在此实施例中，pH调节步骤提高过滤性。因此，在一个实施例中，所述方法包含以下步骤：1)将溶胞产物加热到至少60℃并保持至少30分钟以使蛋白质聚集和沉淀；2)使溶胞产物离心并从溶胞产物中分离出沉淀的蛋白质以产生分离物；3)使分离物的pH值增加到至少8.0；并4)过滤分离物；其中产生实质上纯的含血清3型多糖的分离物。在特定实施例中，在离心之前将溶胞产物加热到约60℃至约70℃并保持约30分钟至约50分钟、更具体地加热到约60℃并保持约40分钟。在另一实施例中，在过滤之前使分离物的pH值增加到介于约8.0至约8.4之间、具体地约8.2。在其它实施例中，过滤步骤包含使用膜过滤器、更具体地0.45μm孔径膜过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。在另一实施例中，过滤步骤包含使用深度过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。