[发明专利]一种松材线虫人工饲养液的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于线虫人工饲养技术领域，具体为一种松材线虫人工饲养液的制备方法。

背景技术

松材线虫Bursaphelenchus xylophilus属蠕形动物门，线虫纲，垫刃目，滑刃总科，伞刃属。线虫成虫虫体细长，体长约1mm，雌虫尾部近圆锥形，末端圆。雄虫尾部似鸟爪，向腹面弯曲。松材线虫病又称松枯萎病，是一种毁灭性病害。国家林业局在2009年第3号公告,松材线虫病疫区为江苏、浙江、安徽、江西、山东、福建、湖北、湖南、广东、重庆、云南、广西、重庆、四川等15个省、区、市的193个县(市、区)。据统计, 2008年全国松材线虫病发生面积96.42万亩,病死松树106.17万株。不仅直接破坏了自然景观及生态环境,给国民经济造成巨大损失,更对我国松林资源,尤其是对我国南方广泛栽植的330多万hm2松林和重要生态区域构成了严重威胁,同时,也严重地影响着我国外贸出口竞争力。根据植物病理学的经典柯赫氏法则,要对由松材线虫引起的松材线虫病进行研究,获得松材线虫的培养方法是整个研究的关键。因此,要对松材线虫进行研究,首先就要获得大量的线虫。前人对松材线虫的培养方法归纳起来主要有2大类3种方法:①单异活体培养——人工培养基培养松材线虫,又分为2种,一种是用人工培养基先培养真菌,然后利用真菌培养;另一种则利用植物组织培养技术培养松树愈伤组织,然后以松树愈伤组织为食料培养。②无异活体培养——人工合成培养基直接培养松材线虫。目前无菌松材线虫的人工培养方法主要有单异活体培养和无异活体法,但也有学者指出: 这两种方法的主要缺点是操作过程较为繁琐,得到的无菌线虫数量较少,难以满足研究需要,食料真菌培养法其操作过程较为繁杂,易污染,难以排除食料真菌或消毒剂对实验的影响;无异活体培养法其培养周期较长,产量较低,而且长期培养还可能会改变松材线虫原有的生物学特性。在黑松愈伤组织上培养无菌松材线虫既克服了食料真菌法的缺点,又较无异活体培养法所用培养周期短,产量要高;但是几次继代后的线虫体型较小,保藏不方便。所以不管是单异活体培养还是无异活体法,建立一套科学完整的松材线虫人工饲养体系,是以后松材线虫人工培养的研究方向和关键。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种松材线虫人工饲养液的制备方法的技术方案，具有饲养成本低，操作简便，应用范围广，线虫产量高，同时不会改变松材线虫原有的生物学特性。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）按照松木屑15-20%、黄瓜15-20%、香蕉15-20%、苹果15-20%、豌豆15-20%、麦芽糖15-20%的比例称取上述物质，均粉碎至150-200目，备用；

2）将松木屑粉碎物用三层纱布包好放入盛满清水的漏斗中，漏斗下接一段8-15 cm长的橡皮管，橡皮管上装一个截流弹簧夹，13-17h后打开弹簧夹，用离心管接取橡皮管中水样；静置15-30 min，然后在转速1500-2000r/min下离心2-5 min，除去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的松材线虫悬浮液，备用；

3）将黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖粉碎混合物加入水中浸泡3-5h，按照粉碎混合物1g加水量4-7ml的比例加水，用两层纱布过滤除去残渣，得到的滤液中再加入真菌，真菌的加入重量为粉碎混合物重量的0.08-0.2倍，充分搅拌均匀，26－30℃下静置2-3h，然后取步骤1）中的松材线虫悬浮液1-2滴，接种到上述饲养液中，即得松材线虫人工饲养液。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤1）中：松木屑的含量为16-18%，黄瓜的含量为16-18%，香蕉的含量为16-18%，苹果的含量为16-18%，豌豆的含量为16-18%，麦芽糖的含量为16-18%。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤2）中：橡皮管的长度为10-12 cm，截流弹簧夹夹住的时间为14-16h，静置时间20-25 min，转速1600-1800r/min，离心时间3-4 min。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤3）中：黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖粉碎混合物在水中浸泡时间3.5-4.5h。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤3）中：静置温度27－29℃，时间为2.2-2.8h。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤3）中所述的真菌为长喙壳菌、酵母菌、毛壳菌、镰刀菌、灰葡萄胞菌中的一种或一种以上混合物。