[发明专利]基于特异性寡核苷酸和纳米金的汞离子(Ⅱ)检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及利用汞离子特异性寡核苷酸探针和纳米金构建一种快速比色检测水中汞离子的纳米生物传感器方法及其试剂盒。 

背景技术

汞离子的检测长期以来一直受到研究人员的高度关注。自工业革命起，汞被运用到生产生活中，环境里的汞含量日益增长，汞污染范围也逐年扩大。据统计，汞在全球水体中的含量比数年前已增加了三倍左右，工业区附近汞的含量则更高。由于汞污染具有高迁移性和持久性，可通过甲基化、生物富集以及食物链放大作用，会对环境以及人类健康造成极大的危害。 

传统的汞离子检测方法包括原子吸收光谱、质谱法等，往往需要大型仪器，成本昂贵，操作复杂耗时，且需要熟练人员操作。近年来，国内外已发展了许多汞离子检测方法，其中利用汞离子可使胸腺嘧啶(Thymine，T)之间形成特异的错配结合(T-Hg²⁺-T)这一特性构建的一系列纳米金方法尤为突出。纳米金是指颗粒尺寸为纳米数量级的金微小颗粒，通常在水溶液中以胶体的形态存在，故又称胶体金。纳米金的最大吸收波长与纳米金的粒径和彼此间距离相关，纳米金粒径从小到大的变化过程中，其颜色由红色变为蓝色；同样地，纳米金的聚集会使吸收峰产生明显的红移而变为蓝色。此外，单链DNA能够以很高的亲和性自发吸附到未加修饰的带负电荷的纳米金颗粒上，而双链DNA的吸附则较弱。因此，在一定浓度的盐离子条件下，有单链DNA吸附的纳米金在单链DNA的保护下较为稳定，在盐溶液中保持良好的分散性而仍然呈红色，而双链 DNA溶液中的纳米金粒子会因为聚集而呈现由红变紫的颜色变化。利用DNA-纳米金这种距离-颜色效应的光学性质，研究者们发展了很多基于纳米金的聚集、分散状态变化的Hg²⁺检测方法。 

2007年初，Mirkin课题组设计了两段寡核苷酸探针，序列分别为5’HS-C10-A10-T-A103’和5’HS-C10-T10-T-T103’。而当溶液中有Hg2+存在时，T-T错配之间因Hg²⁺而形成特异的键合，使得两探针之间的Tm值明显升高，从而定量分析Hg²⁺。但该方法需要严格的温度控制，不易于推广使用。Xuejia Xue等人通过改良组装到纳米金表面的寡核苷酸探针，并引入了第三段序列linkerDNA，使linker DNA能与两个探针序列同时杂交。该检测方法在室温下即可进行，但需要三条寡核苷酸探针，其中两条仍需要经过巯基修饰，繁琐耗时且价格昂贵。Lihua Wang等报道利用一条聚T寡核苷酸探针，通过Hg²⁺特异性稳定T-T错配形成茎环结构，使与聚T寡核苷酸探针结合的纳米金失去保护而在高盐条件下聚集，并产生红色-蓝色的颜色变化，实现对Hg²⁺的快速便捷分析，但灵敏度有待提高。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有的汞离子检测方法存在的不足，提供一种利用优化的汞离子特异性寡核苷酸探针和纳米金快速比色检测水中汞离子的纳米生物传感器方法及其试剂盒。 

本发明的第一个目的是公开一种新型的纳米生物传感器，以及利用此传感技术进行快速检测汞离子的方法。这种新方法可包括以下步骤： 

(1)将待检测水溶液和汞离子寡核苷酸探针混合，室温反应； 

(2)将纳米金加入到上述溶液中，室温反应； 

(3)最后加入NaNO₃，观察颜色变化，并进行可见光光谱检测。 

本发明的第二个目的是提供一种基于纳米生物传感器的汞离子快速检测试剂盒，它含有： 

(1)纳米金，其粒径约15nm，浓度约为2.97nmol/L； 

(2)两种汞离子寡核苷酸探针，最适浓度都为10μmol/L； 

(3)NaNO₃溶液，最适浓度为0.5mol/L； 

(4)阳性对照溶液和阴性对照溶液； 

(5)说明书。 

试剂盒中的纳米金、汞离子寡核苷酸探针和NaNO₃溶液等可以是浓缩液。 

我们对已有汞离子寡核苷酸探针的进行了优化设计，去除非特异的环部分(4bp)，截取两端的茎部分(9bp)，经试验成功获得信噪比更高的汞离子特异性核苷酸探针。原因可能是单链DNA吸附于纳米金的效率与序列的长度有关，即短序列比长序列吸附效率更高，从而能使纳米金在高盐条件下更稳定，这与Huixiang Li等人报道一致。