[发明专利]一种GPC3抗原多肽，抗GPC3的多克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种GPC3抗原多肽，抗GPC3的多克隆抗体及其应用。

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (glypican-3, GPC3) 是膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在胎儿肝脏表达丰富，在成人肝脏不表达，于肝癌发生时常常再激活，是肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）发生发展中的一个重要物质，它不但在肿瘤组织中特异性高表达，同时也可在外周血中被检测，其量的变化又与HCC病灶的存在与否、病情的严重程度密切关联（可反映手术前后的状态及治疗效果，较AFP敏感）。尤其是，GPC3在AFP阴性肝癌中特异性表达，联合检测AFP和GPC3，可显著提高HCC的诊断检测率和准确性，因此被认为是一种极具潜能的新颖肝癌标志物。免疫组化结果显示，在70％～80％的肝细胞癌中可以检测到GPC3过表达，而正常肝细胞、胆管细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞均未见表达，癌旁组织不表达GPC3蛋白。阳性染色主要位于细胞质和细胞膜，呈细颗粒状。阳性细胞常簇集形成克隆样区域，和阴性细胞形态明显不同。假如癌旁组织中发现该蛋白表达，可能要考虑已有转移性卫星灶存在。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝癌标志物GPC3抗原多肽。

本发明的另一目的是提供一种抗GPC3的多克隆抗体。

本发明的又一目的是提供上述抗GPC3的多克隆抗体的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种GPC3抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列C端连接一个半胱氨酸。在C端加入半胱氨酸是为了便于与载体蛋白偶联。

一种抗GPC3的多克隆抗体，是以前述GPC3抗原多肽为免疫原，免疫动物制备而成。

上述抗GPC3的多克隆抗体的制备方法，步骤如下：GPC3抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫新西兰兔，期间进行两次以上免疫，待ELISA检测血清抗体效价达1:8000后，采集兔血清，经过纯化、ELISA和western blot鉴定后，得到抗GPC3的多克隆抗体。

化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白交联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T辅助细胞，进而诱导 B细胞反应。用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中最普遍使用的载体是匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和牛甲状腺球蛋白（bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，与本发明的GPC3抗原多肽交联后免疫原性最强，因此本发明选用KLH作为偶联载体蛋白。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。

GPC3的多克隆抗体在制备肝癌诊断试剂中的应用，所述肝癌为肝细胞性肝癌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明对GPC3蛋白氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的一段肽序列进行人工合成；将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体mcKLH偶联，将此偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫新西兰兔；经过多次免疫的兔血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达理想值后收集免疫兔血清，并用Protein G蛋白纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA、western bot等鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别GPC3蛋白，可用于检测肝癌细胞表达的GPC3蛋白，为肝癌诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。

附图说明

图1. 经DNAstar软件分析GPC3免疫原性、亲疏水性及表面可及性，方框中显示的是选用合成的多肽序列片段。

图2. 抗GPC3的多克隆抗体经protein G凝胶柱纯化后的SDS-PAGE电泳(12%)检测结果。泳道 1：蛋白Marker；泳道2：上样峰；泳道3：流穿峰；泳道4：平衡峰；泳道5：洗脱上峰；泳道6：洗脱下峰。

图3. 抗GPC3的多克隆抗体的western-blot鉴定结果，上样为HepG2细胞（人肝癌细胞系）裂解液。

具体实施方式