[发明专利]检测耳聋相关基因GJB3基因突变的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种检测耳聋相关基因GJB3基因突变的试剂盒。

背景技术

在中国，听障人群超过2千万，儿童患者约80万，且每年新发耳聋患儿8万名。这些患者大都患有严重影响交流且治疗困难的感音神经性耳聋，其中遗传因素所致耳聋占50%以上。按照不同的遗传方式可将遗传性耳聋分为：1，常染色体显性遗传性聋；2，常染色体隐性遗传性聋；3，线粒体基因突变引起的耳聋；4，伴性遗传性聋。一般认为, 耳聋患者中50%是由遗传物质发生改变导致的。

在我国除GJB2、SLC26A4和mtDNA12s rRNA（线粒体XLT）基因突变导致的耳聋外，GJB3也是导致耳聋的原因之一。GJB3基因定位于人类染色体1p33- p35，其完整的编码序列包含由813个核苷酸组成的开放阅读框、位于启始密码子ATG上游25个核苷酸处的剪切点、以及3’端非翻译区。编码有270个氨基酸的缝隙连接蛋Connex-in31，全长3617bP，Cx31分子量为30.8kD。蛋白质结构分析确定其为p-缝隙连接蛋白。每个胞外环包含3个保守的半胱氨酸残基。编码Connex-in31的基因(GJB3)。缝隙连接分布广泛，几乎存在于所有的动物细胞中。缝隙连接是由连接蛋白形成的、连接相邻细胞的亲水性跨膜通道，介导细胞间通讯。内耳中的缝隙连接主要存在于非感觉上皮细胞各亚群间。其中包括耳蜗内的支持细胞和连接组织细胞如螺旋韧带中的纤维细胞、血管纹的基底细胞及中间细胞等。缝隙连接蛋白基因突变影响钾离子循环途径，从而影响内淋巴电位，最终导致毛细胞功能异常。

GJB3基因突变可以引起常染色体显性或者隐性遗传非综合征耳聋。如：第547位碱基G→A突变，导致第183号氨基酸有谷氨酸变成赖氨酸；第538位碱基的C→T突变，导致第180号氨基酸变为终止密码子；第423位碱基A→G的突变，导致第141号氨基酸由异亮氨酸变成缬氨酸。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种检测耳聋相关基因GJB3基因突变的试剂盒，可用于检测GJB3基因突变位点。

检测耳聋相关基因GJB3基因突变的试剂盒，其特征在于，包括：

(i) PCR扩增反应试剂；

(ii) 用于扩增样本DNA中GJB3基因的PCR引物：JB3上游引物序列：GGTCGTTGTGAGTATTGAAC；GJB3下游引物序列：AGGTCCTACAGGGGCTG AGTGACCC。

进一步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

   (i) 采集待测血液样本，提取DNA；

(ii) 以该DNA为模板，用所述用于扩增样本DNA中GJB3基因的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物；

(ⅲ) 对PCR反应产物测序，与GJB3正常基因序列进行比较，确定是否存在第547个碱基G→A突变位点、第538碱基C→T突变位点、第423-425碱基ATT缺失位点或第423碱基A→G突变位点。

步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增：94 ℃  2 min；98 ℃  10s、66 ℃  30s、68 ℃  40s、16 个循环；98 ℃  10s、60 ℃  30s、68 ℃  40s、20个循环；68 ℃  6 min。

由于中国人GJB3基因中547 G→A、538 C→T突变导致染色体显性非综合征耳聋；423 A→G导致隐性非综合征耳聋。因此可以通过同野生型样品的GJB3基因中上述位点进行比对，设计合适的正反向引物对GJB3基因进行扩增，并对扩增产物进行直接测序。可用于判断是否存在547 G→A、538 C→T、423 A→G突变。

本发明试剂盒中用于扩增GJB3基因的PCR引物，其中正向引物GJB3的3’末端位于如序列SEQ ID NO:1所示的GJB3基因编码区上游约138bp处，反向引物GJB3的3’端位于该编码区的下游约906bp处，正反相引物大小分别为20bp，25bp，并能完全扩增GJB3基因编码区。SEQ ID NO:1给出了GJB3编码区的基因序列。

上述引物通过如下的方案进行设计：使用Primer 6.0r软件协助设计引物，通过PCR扩增，将GJB3编码区完全扩增，然后进行直接测序，通过测序检测547 G→A、538 C→T、423 A→G位点是否发生突变。

 GJB3上游引物序列：GGTCGTTGTGAGTATTGAAC

GJB3下游引物序列：AGGTCCTACAGGGGCTGAGTGACCC