[发明专利]高通量全基因组水平捕获染色质核小体空缺区的新方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，涉及高通量全基因组水平捕获染色质核小体空缺区的新方法。

背景技术

后基因组时代研究的主要内容是基因的在基因组水平上调控机制，其中核小体定位以及其化学组成、其成分的修饰是重要的研究内容[1-6]。构成染色质的基本结构单位是核小体，正是核小体使DNA线性结构长度压缩了约10000倍，核小体结构在压缩基因组的同时，也限制了转录因子与DNA之间的结合。两分子的组蛋白H2A、H2B、H3和H4构成八聚体的核心组蛋白。长度约146bp的DNA分子在组蛋白八聚体上盘绕1.65圈形成核小体的核心颗粒，每个核小体之间由约60个碱基围绕着H1组蛋白的连接子连接[7-10]。以核小体形式存在的DNA会影响转录的每个过程，包括从转录起始复合物前体的结合到延伸的每一个阶段。146bp的DNA围绕组蛋白八聚体1.65圈；其中有14个组蛋白与DNA连接位点[11]。在生理条件下蛋白与DNA的结合形成的核小体是相对稳定存在的。但核小体并不是一个简单的稳定性的结构，它受很多蛋白复合体的调节并拥有不同的动态时相从而行使很复杂的生命活动。全基因组研究表明启动子区域的核小体的密度远远低于编码区的核小体密度。Yuan等人首次用高通量基因芯片技术发现在酵母基因启动子区都存在约200bp的核小体空缺区域[12]。早期和实验和严格的数学模型都支持这一假说：核小体的包装信号在全基因组序列上有序列依赖性[13]。通过这种数学模型预测在DNA的转录因子结合的位点有着低水平核小体占位，相反在DNA没有转录因子结合位点有着稳定的核小体占位。因而，真核细胞基因组里有序列特异性的转录因子结合位点，这些位点可以有蛋白靠近，所以在基因激活的第一步，这些序列比形成核小体的DNA序列更容易被刺激信号所激活。

核心组蛋白八聚体对特定的DNA序列有一定的选择性其选择性较其他序列高约1000倍；也有一些DNA序列特异性的DNA结合蛋白如转录因子等反式作用元件与DNA结合时，会阻止核小体结构的形成，从而导致数百个碱基对的DNA双链上没有核小体结构，我们称为核小体空缺区域(Nucleosome Free Region)[14]。这些核小体空缺区域经常发生在基因的转录起始位点或者转录终止点，或者转录因子结合的部位、或者转录活性较高的部位，这些位点对一些非特异的核酸酶如DNase I、MNase敏感[15]。核小体空缺区域的发现使我们对真核细胞转录调控机制有深刻的了解。目前许多研究试图用生物信息学计算机预测的办法，在基于DNA序列的前提下对酵母、人类、果蝇的核小体定位进行预测，并且更多的更复杂的算法不断出现。这种预测在统计学上行得通，但是与实验检测的核小体定位比起来，精确度会小很多。本发明以人宫颈癌细胞系HeLa S3为模型，采用染色质上DNA缺刻平移biotin掺入标记、磁珠沾取biotin DNA获得核小体空缺区域文库。结合高通量测序技术建立了全基因组水平上核小体空缺区域捕捉技术。为全基因组范围内更精确的定位活性染色质核小体空缺区域的研究提供新的方法。可以用来研究真核细胞转录调控的染色质区域，为基因组学研究提供了一个有效方法。

发明内容

本发明提供一种高通量全基因组水平捕获染色质核小体空缺区的新方法。

本发明中使用的细胞HeLa S3是本领域技术人员熟知的人宫颈癌细胞系。在优选的实施方案中，使用的工具酶是脱氧核糖核酸酶I(DNase I)，S1核酸酶(S1nuclease)处理细胞核。最优选的方法是本发明中的采用中性甲醛固定细胞核，DNase I做缺刻，S1核酸酶切取缺刻DNA，缺刻DNA平移biotin掺入，磁珠沾取biotin-DNA构建文库的方法，以及通过该方法构建的HeLa S3细胞活性染色质NFR文库。

本发明涉及高通量全基因组水平捕获染色质核小体空缺区的新方法。它在基因组相关研究中有潜在的用途。

附图表说明

图1NFR片段扩增文库琼脂糖凝胶电泳

Mr1100bp DNA ladder

1、无DNase I酶切未掺入biotin-dATP的阴性对照

2、无DNase I酶切的阴性对照

3、未掺入biotin-dATP的阴性对照

4、DNase I酶切掺入biotin-dATP的NFR文库

图2NFR文库的特异性验证电泳图

Mr 100bp DNA Ladder