[发明专利]猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于猪细小病毒疫苗技术领域，具体涉及一种猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

猪细小病毒病作为一种重要的母猪繁殖障碍疾病，对母猪和种猪的危害都很大，疫苗免疫预防是控制该病的主要手段。现在国内规模化猪场的存栏母猪及种猪场的种猪和后备种猪都需要进行该病的免疫预防接种。灭活疫苗作为预防PPV常用疫苗，具有安全、长效等很多优点，但存在常规白油佐剂疫苗免疫机体后不能产生较好的细胞免疫应答。常规铝佐剂具有注射部位偶有红疹、皮下结节、接触性过敏等症状和增加易感个体的敏感性等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是制备一种新型佐剂，提供一种猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法。

本发明的技术方案是：猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗，该疫苗由灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合制成。

所述的猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下：

（1）将猪细小病毒增值、纯化、灭活；

（2）制备纳米铝佐剂，将氯化铝溶于蒸馏水中，氯化铝与蒸馏水的质量比为1:20-30，制成氯化铝溶液，将质量浓度分数为25-28%的氨水滴入氯化铝溶液中，调节pH为9.0，搅拌10-15分钟，得到白色沉淀物，为氢氧化铝胶，然后采用超速离心法收集氢氧化铝胶沉淀，再用水洗，后转移至锥形瓶中，加入蒸馏水制成悬浮液，蒸馏水的加入量为氯化铝质量的10-15倍，在75-85℃下用磁力搅拌器不断搅拌，用1 mol /L HCl调pH至3.0-4.0，反应持续8-10 h后得到透明的氢氧化铝胶，最后，氢氧化铝胶用双蒸水透析纯化24-28小时，将pH调至6.0，制成纳米铝胶佐剂；

（3）将灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合，振荡均匀，制成猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗。

所述步骤（2）中的氯化铝为六水结晶氯化铝或无水氯化铝。

本发明的有益效果是：本发明在乳鼠和猪体上对疫苗进行了安全性评价，结果发现，免疫之后无一只乳鼠死亡，无一头仔猪发生致敏反应，同样也未观察到明显的全身和局部反应，充分证明本发明灭活疫苗是安全、可靠的。本发明猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗组在免疫第4周时CD4⁺/CD8⁺的比值显著高于其他疫苗组，其比值由2.11提高到2.97，说明该疫苗加强了小鼠的细胞免疫状态。本发明猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗能诱导IFN-γ的分泌表达，该疫苗能显著增强Th1型细胞产生免疫应答反应，诱导其分泌IFN-γ，从而增强细胞免疫水平，能产生较强的细胞免疫应答。

附图说明

图 1为PPV 灭活效果PCR检测结果，M:.DNA marker DL2000；1.灭活16 h；2. 灭活20 h；3. 灭活24 h；4.灭活36 h；5.灭活48h；6.灭活72 h；

图2为血清抗体水平的检测结果；

图3为免疫后小鼠外周血CD3+细胞所占百分比；

图4为免疫后小鼠外周血CD3⁺ CD4⁺细胞所占百分比；

图5为免疫后小鼠外周血CD3⁺CD8⁺细胞所占百分比；

图6为免疫后小鼠外周血CD4+/CD8+的动态变化；

图7为IL-4的标准曲线；

图8为接种疫苗后小鼠血清中IL-4水平；

图9为IFN-γ的标准曲线；

图10为 免疫后小鼠血清中IFN-γ水平；

图11为免疫后血清中HI抗体动态变化（log2）；

图12为免疫后血清中ELISA抗体动态变化；

图13为灭活苗免疫后猪外周血CD3+细胞所占百分比；

图14为灭活苗免疫后猪外周血CD3⁺CD4⁺细胞所占百分比；

图15为灭活苗免疫后猪外周血CD3⁺CD8⁺细胞所占百分比；

图16为纳米铝胶佐剂的XRD表征图。

具体实施方式

猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗，该疫苗由灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合制成。

所述的猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下：

（1）将猪细小病毒增值、纯化、灭活；