[发明专利]用汉逊酵母表达系统产生HPV11 L1蛋白的方法

权利要求书

1.一种产生HPV11 L1蛋白的方法，包括以下步骤：

a)产生表达人乳头瘤病毒11型L1(HPV11 L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞；

b)在适于所述HPV11 L1蛋白表达的条件下培养a)中获得的重组汉逊酵母细胞；和

c)从培养物中回收并纯化所述HPV11 L1蛋白；和

d)对所纯化的HPV11 L1蛋白进行解聚和重聚；

其中a)中通过包含以下步骤的方法产生表达HPV11 L1蛋白的重组汉逊酵母细胞：

a1)通过将包含与MOX启动子和MOX终止子可操纵地连接的SEQ ID NO:4所示的HPV11L1蛋白编码序列的外源多核苷酸插入序列示于SEQ ID NO:15的载体来构建表达构建体；

a2)用步骤a1)中获得的表达构建体转化ATCC26012汉逊酵母细胞；和

a3)用Zeocin和G418对步骤a2)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有拷贝数大于30的所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞，其中b)中的培养包括以下步骤b1)和b2)：

b1)制备发酵种子液：取所述重组汉逊酵母细胞冻存甘油菌50μl接入5ml YPD培养基中，于37℃、200rpm摇床培养20-24hr至A_600nm2-5，吸取1ml接入500ml YPD培养基中，于37℃、200rpm摇床培养20-24hr至A_600nm15-20，作为发酵种子液待用；

b2)发酵：500ml发酵种子液加入至30L发酵罐中的发酵起始培养基，发酵体积为15L；起始搅拌转速为200rpm、空气流量0.5Nm3/hr、罐压0.5bar，发酵中控制溶氧值为20-80％；起始生长期维持约25hr后，菌液A600nm达到20，溶氧开始快速上升，开始以100ml/hr流速流加补料培养基；培养6-8hr后，菌液A600nm达到90，停止流加，氨水调节pH值至6.0；溶氧开始回升后开始流加甲醇进入诱导表达期，甲醇初始流加速率为50ml/hr，每小时取样，甲醇电极测定甲醇浓度，通过调节甲醇流加速率控制甲醇浓度＜5g/L；诱导10hr后下罐，4℃条件下以5000rpm离心30min收集湿菌体并-20℃冻存；

其中c)中的回收和纯化包括以下步骤c1)和c2)：

c1)取-20℃保存的湿菌体，按照10ml/g湿菌体的比例加入0.9％生理盐水清洗；菌体洗涤后，按20ml缓冲液/g湿菌体加入破碎缓冲液充分溶解，使用高压匀浆破碎，破碎压力1500bar，循环破碎5-8遍，镜检破碎率＞90％；菌体破碎液在4℃条件下以10000rpm离心30min，收集上清液，再加入50％硫酸铵，沉淀30min后，4℃条件下10000rpm离心30min，收集上清液；

c2)经1μm过滤的菌体破碎上清液，上样于层析介质POROS 50HS，以0.5M-1.5M NaCl梯度洗脱，收集洗脱的HPV11 L1蛋白；将初纯的HPV11 L1蛋白上样于层析介质Macro-Prep陶瓷羟基磷灰石，用20-200mM磷酸盐浓度梯度洗脱，收集洗脱的HPV11 L1蛋白；

其中d)中的解聚和重聚包括以下步骤：

纯化后的HPV11 L1蛋白加入25mM DTT，0.05％的Polysorbate80，于pH8.2条件下，在室温解聚2小时；针对1.0M NaCl，20mM磷酸盐，0.05％Polysorbate80，pH 7.2的透析体系按1:100比例透析3次，每次30min，去除DTT；再针对1M NaCl,5mM Ca²⁺，60mM柠檬酸钠，pH6.2，0.05％Polysorbate80的透析体系透析到重聚缓冲液中；于4℃，透析20-24小时后获得重聚的HPV11 L1蛋白。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤a3)中用0.25mg/ml的Zeocin和10mg/ml的G418对步骤a2)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤a3)中所述筛选包括

1)将步骤a2)中获得的汉逊酵母细胞涂布于含0.25mg/ml Zeocin的YPD平板中，于37℃倒置培养3-5天；

2)挑取于含0.25mg/ml Zeocin的YPD平板上长出的单菌落，接种于5ml含0.25mg/mlZeocin的YPD液体培养基中，于37℃、200rpm摇床培养24-36小时，至OD值达50后，以1:1000的比例转接于5ml含0.25mg/ml Zeocin的YPD液体培养基中，培养至OD值达50后，再以1:1000的比例转接于5ml含0.25mg/ml Zeocin的YPD液体培养基中，连续传10次；

3)将传至10次的重组汉逊酵母表达菌株接入5ml不含Zeocin抗性的YPD液体培养基中，于37℃、200rpm摇床培养至OD值达50后，以1:1000的比例转接于5ml YPD液体培养基中，在不含Zeocin抗性的YPD液体培养基中连续传5次；和

4)将获得的产物涂布在含10mg/ml G418的YPD平板，于32℃倒置培养2-3天，挑取生长旺盛的单菌落进行拷贝数检测。