[发明专利]一种高亲和力青霉素结合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域。更具体的，本发明涉及分子改造获得的高亲和力青霉素结合蛋白及其在农副产品中β-内酰胺类抗生素残留快速检测中的应用。

背景技术

奶牛在养殖过程中易患乳房炎、阴道炎等疾病，由于β-内酰胺类抗生素药效好、价格低廉，奶农在奶牛患病时大量使用，导致原料乳中β-内酰胺类抗生素残留现象普遍，在很大程度加大了乳制品企业奶源质量安全控制的难度，而含有β-内酰胺类抗生素残留的乳制品会影响到消费者的身体健康和生命安全。因此，农业部出台了行业标准《无公害食品 生鲜牛乳》(NY5045-2008)，要求乳制品企业必须检测原料乳中β-内酰胺类抗生素残留。

青霉素结合蛋白是细菌细胞壁合成的重要的酶，具有β-内酰胺环结构的抗生素类似其底物，与其可发生不可逆结合。因此，青霉素结合蛋白是实现β-内酰胺类抗生素残留快速检测最具潜力的蛋白。但目前已知的青霉素结合蛋白与β-内酰胺类抗生素的亲和力达不到国家要求的检测标准，为实现快速检测β-内酰胺类抗生素，迫切需要找到与β-内酰胺类抗生素亲和力更高的青霉素结合蛋白。

目前，乳制品企业使用的β-内酰胺类抗生素快速检测产品主要以进口产品为主，如美国Snap公司和比利时UniSensor公司。本发明针对我国β-内酰胺类抗生素快速检测产品存在的检测限达不到国家标准问题，利用计算机辅助设计、量子化学、分子生物学、分析化学等方法，对无乳链球菌青霉素结合蛋白(PBP 1b)的第526位和547位氨基酸进行分子改造，开发了一种新的高亲和力青霉素结合蛋白。本发明中，命名这种高亲和力青霉素结合蛋白为WFYZH-Pro-β-lactam，其对应基因为WFYZH-Gen-β-lactam，表达载体为WFYZH-Bdzt-β-lactam。本发明以WFYZH-Pro-β-lactam作为分子识别原件，开发了一种β-内酰胺类抗生素快速检测试纸条。

发明内容

本发明的目的是提供一种与β-内酰胺类抗生素亲和力更高的青霉素结合蛋白(WFYZH-Pro-β-lactam)。本发明涉及的保藏菌株为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院，100101，中国)，保藏日期2011年10月24日，保藏编号CGMCC No.5381。

本发明的另一个目的是提供一种基于WFYZH-Pro-β-lactam生产的能达到或超过国家检测标准的β-内酰胺类抗生素残留快速检测试纸条。

本发明的第一方面，提供了WFYZH-Pro-β-lactam：将PBP 1b的第526位的异亮氨酸和第547位的谷氨酰胺改造为赖氨酸和精氨酸，制备原核表达载体转化大肠杆菌BL21制得阳性菌株(命名为WFYZH-Gchj-β-lactam，CGMCC No.5381)进行表达，并通过分离纯化、活性测定和蛋白鉴定获得WFYZH-Pro-β-lactam。

本发明的第二方面，提供了一种基于WFYZH-Pro-β-lactam开发的β-内酰胺类抗生素快速检测试纸条。

在本发明实施例中，提供了基于WFYZH-Pro-β-lactam加工试纸条的方法。

附图说明

图1是WFYZH-Pro-β-lactam的对应基因测序结果。

图2是WFYZH-Pro-β-lactam的对应氨基酸测序结果。

图3是试纸条示意图。

具体实施方式

本发明将PBP 1b的第526位的异亮氨酸和第547位的谷氨酰胺改造为赖氨酸和精氨酸，并通过原核表达载体制备、表达纯化、活性测定、蛋白鉴定等，获得了WFYZH-Pro-β-lactam，其与β-内酰胺类抗生素的亲和力大幅提高。