[发明专利]嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法，尤其涉及一种无痕敲除嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因或将外源基因插入嗜酸性喜温硫杆菌染色体的方法，以及一种染色体基因无痕敲除和整合中用于同源重组的自杀型质粒载体pSDUDI，和一种嗜酸性喜温硫杆菌中表达大范围核酸内切酶的质粒pSDU1-I-SceI。

背景技术

嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caduls，简称A.caldus)，是一类革兰氏阴性专性自养硫氧化细菌，在细菌浸矿中发挥十分重要的作用，能够显著提高铁氧化细菌如Acidithiobacillus ferroxidans、Leptospirillum ferrooxidans等的浸矿效率。近年来研究发现A.可从下述3个方面提高铁氧化细菌caldus    的浸矿效率：(1)A.caldus的生长，能利用附着在矿物表面的固体硫，暴露出矿物表面，从而使近况细菌充分接触到矿物并起作用；(2)A.caldus生长产生的有机物有助于促进异养或混合营养型浸矿细菌的生长；(3)A.caldus的代谢物具有表面活性作用，促进单质硫溶解^[1](Dopson M，Lindstorm EB.；Appl Environ Microbiol.；1999；Vol.65；No.1；36-40)。因此，A.caldus的生长对细菌浸矿效率具有重要影响，引起了人们的广泛关注。但是，作为自养细菌，A.caldus具有生长缓慢，代时长，细胞得率低等特点，而且浸矿液中常常含有毒性重金属离子，也抑制了其生长。因此，用遗传学的方法深入研究A.caldus的生长代谢和改造A.caldus，提高其生长速率，是当前该领域的一个重要课题。

对于嗜酸性喜温硫杆菌的遗传操作方法，研究进展比较缓慢，发明人所在实验室在国际上率先使用接合转移方法将外源基因通过大肠杆菌转移到A.caldus菌内^[2](Liu X，Lin J，Zhang Z，et al.，J.Microbiol.Biotechnol.，2007，Vol.17，No.1，162-167)。之后发明人所在实验室又在国际上率先使用电转化方法将外源基因转入A.caldus菌内，提高了转化效率，简化了操作^[3](Chen L，Lin J，Li B，Lin J，Liu X.，J Microbiol Biotechnol.，2010，Vol.20，No.1，39-44)。基因敲除和整合是深入研究细菌基因功能、细菌生长代谢和细菌分子改造的重要方法，Rawlings所在的实验室曾报道利用A.caldus自身同源重组系统，将A.caldus的arsB和tetH基因置换为Km基因，从而达到基因敲除的目的^[4](Leonardo J.van Zyl，Jolanda M.van Munster，and Douglas E.Rawlings.，Appl Environ Microbiol.，2008，Vol.74，No.18，5686-5694)，但是此敲除方法的效率不稳定，从23株菌中筛到1株arsB敲除菌株，从249株菌中筛到1株tetH敲除菌株，而且此敲除方法每敲除一个基因，需要引入一个抗生素抗性基因，鉴于在A.caldus能够使用的有效抗生素数目有限，所以此敲除方法无法在同一株菌中敲除多个基因，除此之外没有在A.caldus中敲除基因的报道。因此，国际上尚无高效无痕敲除A.caldus基因或将外源基因插入A.caldus染色体方法的报道。

发明内容

针对基因敲除和整合是深入研究细菌基因功能、生长代谢和细菌分子改造的重要方法，而国际上尚无高效无痕敲除A.caldus基因或将外源基因插入A.caldus染色体方法的报道，本发明提出了一种无痕敲除嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因或将外源基因插入嗜酸性喜温硫杆菌染色体的方法，以及一种A.caldus基因无痕敲除和整合中用于同源重组的自杀型质粒载体pSDUDI，和一种用于酶切染色体的大范围核酸内切酶的表达质粒pSDU1-I-SceI。

本发明所述无痕敲除嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因或将外源基因插入嗜酸性喜温硫杆菌染色体的方法，步骤包括构建同源重组的自杀型质粒载体，在载体的多克隆位点处插入同源臂得到同源重组质粒，将构建的同源重组质粒通过化学转化法转入大肠杆菌SM10菌株，通过接合转移法将同源重组质粒从E. coliSM10菌转入嗜酸性喜温硫杆菌中，平板筛选单交换子并进一步鉴定，构建大范围核酸内切酶I-SceI的表达质粒并用电转化法转入单交换子中，平板筛选双交换子并进一步鉴定；