[发明专利]地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域。具体地，本发明涉及地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途。

背景技术

地中海贫血(thalassemia，地贫)是一组全球最常见的单基因遗传病，是由于珠蛋白基因缺陷导致血红蛋白(hemoglobin，Hb)功能异常的疾病，表现为慢性进行性溶血性贫血。地贫在我国广东、广西等地的人群中发病率非常高，目前主要依赖定期输血进行维持治疗，给病人及社会带来了沉重的负担。其中，重型β地中海贫血的治疗难度更大。异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前根治重型β地中海贫血的惟一临床手段。但众所周知，造血干细胞的来源及移植后的排斥极大限制了其临床应用。

多能性干细胞(pluripotent stem cell)是一类能够维持自我更新并具有多潜能分化能力的干细胞，在再生医学方面具有广阔的应用前景。而通过诱导性多能干细胞(iPS细胞)技术，能够获得充足的、自体来源的iPS细胞，从而能够将获得的iPS细胞应用于疾病治疗例如β-地中海贫血的治疗，并且能够有效地避免免疫排斥问题。

然而，目前的诱导性多能干细胞技术，尤其是制备地贫诱导多能干细胞的方法，仍有待改进。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：目前的诱导性多能干细胞技术，具有外源基因整合等问题，可能会影响插入基因的表达调控。

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效制备地贫诱导多能干细胞的方法。

为此，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种地贫诱导多能干细胞。根据本发明的实施例，该地贫诱导多能干细胞衍生自地中海贫血症患者的体细胞，并且该诱导多能干细胞的基因组中包含正常β珠蛋白基因。根据本发明实施例的地贫诱导多功能干细胞或其衍生物能够在适当的条件下有效地分化为造血干细胞，并且该造血干细胞能够表达正常β珠蛋白基因，进一步造血干细胞能够被引入地中海贫血症患者体内，从而能够有效地治疗地中海贫血症。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备地贫诱导多能干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将多能干细胞诱导因子引入地中海贫血症患者的体细胞中，其中，地中海贫血症患者体细胞基因组中的β珠蛋白基因与正常β珠蛋白基因相比，存在选自下列的至少一种突变：CD41/42(-4bp)、IVS-II-654(C→T)、CD71/72(+A)、-28(A→G)、CD17(A→T)、IVS1-1(G→T)、IVS1-5(G→C)、CD8/9(+G)、CD15(G→A)、CD26(G→A)和CD30(G→C)；将引入多能干细胞诱导因子的体细胞在适于重编程的培养基中进行培养，以便获得原始诱导多能干细胞；以及向原始诱导多能干细胞中引入编码正常β珠蛋白的核酸，以便获得地贫诱导多能干细胞，该地贫诱导多能干细胞的基因组中包含正常β珠蛋白基因。利用根据本发明实施例的制备地贫诱导多能干细胞的方法，能够有效地制备地贫诱导多能干细胞，并且获得的地贫诱导多能干细胞能够在适当的条件下有效地分化为造血干细胞，并且该造血干细胞能够表达正常β珠蛋白基因，进一步造血干细胞能够被引入地中海贫血症患者体内，从而能够有效地治疗地中海贫血症。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，该载体包括：第一核酸分子，该第一核酸分子包含编码正常β珠蛋白的核酸序列；第二核酸分子，该第二核酸分子位于第一核酸分子的5’侧，并且第二核酸分子包含编码筛选基因的核酸序列；两个loxP位点，这两个loxp位点分别位于第二核酸分子的5’侧和3’侧，其中位于第二核酸分子5’侧的loxP位点位于第二核酸分子和第一核酸分子之间。由此，利用该载体转化地中海贫血症患者的体细胞，能够获得地贫诱导多能干细胞，并且其能够在适当的条件下有效地分化为能够表达正常β珠蛋白基因的造血干细胞，从而本发明的载体能够成功修复地中海贫血症患者体细胞中的突变。并且在修复成功后，能够通过cre重组酶将两个loxp位点之间的筛选基因从细胞基因组中删除，从而能够避免外源基因的干扰，维持原始细胞的基因组完整性。