[发明专利]基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒

权利要求书

1.将目标DNA克隆到载体中的方法，包括：

(a) 将第一序列和第二序列分别添加到线性化载体的两端，其中第一序列与目标DNA的第一末端或其侧翼序列同源的序列，第二序列与目标DNA的第二末端或其侧翼序列同源的序列，获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体，所述第一序列和第二序列各自独立地长至少12个核苷酸，优选15-50个核苷酸，更优选35-50个核苷酸；

(b) 使延长的线性化载体与含有目标DNA的样品接触，通过同源重组将目标DNA克隆到载体中。

2.权利要求1的方法，其中步骤(a)如下进行：

(i) 提供第一引物、第二引物和载体，其中第一引物包含作为5’端的所述第一序列和作为3’端的对载体第一区域特异性的序列，第二引物包含作为5’端的所述第二序列和作为3’端的对载体第二区域特异性的序列，优选对载体第一区域特异性的序列为与载体第一区域互补的序列，优选对载体第二区域特异性的序列为与载体第二区域互补的序列；和

(ii) 将第一引物、第二引物和载体接触，以载体为模板通过聚合酶链式反应，获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体。

3.权利要求2的方法，其中作为聚合酶链式反应模板的载体为线性化载体，所述第一区域和第二区域优选分别为线性化载体的第一末端和第二末端。

4.权利要求2的方法，其中作为聚合酶链式反应模板的载体为环状载体。

5.权利要求1的方法，其中步骤(a)如下进行：

(i) 提供第一连接片段、第二连接片段和载体，其中第一连接片段具有与目标DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列和与载体第一区域同源的序列，第二连接片段具有与目标DNA第二末端或其侧翼序列同源的序列和与载体的第二区域同源的序列；和

(ii) 将第一连接片段、第二连接片段和载体接触，通过同源重组获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体。

6.将目标DNA克隆到载体中的方法，包括：

(a) 提供第一连接片段、第二连接片段和载体，其中第一连接片段具有与载体的第一区域同源的序列和与目标DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列，第二连接片段具有与载体的第二区域同源的序列和与目标DNA第二末端的侧翼序列同源的序列；和

(b) 将第一DNA片段和第二DNA片段与线性化载体以及含有目标DNA的样品接触，通过同源重组将目标DNA克隆到载体中。

7.权利要求1－6中任一项的方法，其中所述同源重组在核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白存在下进行，所述核酸外切酶优选选自大肠杆菌核酸外切酶I、大肠杆菌核酸外切酶III、大肠杆菌核酸外切酶VII、λ噬菌体核酸外切酶、T7噬菌体核酸外切酶、Redα、RecE和它们的混合物，所述单链DNA结合蛋白或退火蛋白优选选自极端热稳定单链DNA结合蛋白(ET SSB)、Rec A、T4基因32蛋白、嗜热栖热菌RecA (Tth RecA)、大肠杆菌单链DNA结合单链(SSB)、Redβ、RecT和它们的混合物。

8.权利要求1－6中任一项的方法，其中所述同源重组在RecE和RecT存在下或在Redα和Redβ存在下进行。

9.权利要求1－6中任一项的方法，其中所述同源重组在RecE、RecT、Redα和Redβ存在下进行。

10.用于将目标DNA克隆到载体中的试剂盒，其包含：

(a) 酶混合物，其包含核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白；和

(b) 反应缓冲液。