[发明专利]一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法

权利要求书

1.一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法，包括以下步骤： 

1)设计一对通用引物，包括上游通用引物和下游通用引物；

2)分别设计三种TaqMan探针，分别作为α1珠蛋白基因、α2珠蛋白基因和内参基因的TaqMan探针；

3)分别设计上述α1珠蛋白基因、α2珠蛋白基因和内参基因的加尾引物，上游加尾引物从5’至3’端的序列依次为上游通用引物的结合序列、相应基因的TaqMan探针的结合序列、基因特异识别序列，下游加尾引物从5’至3’端的序列依次为下游通用引物的结合序列、相应基因的特异识别序列；

4)样本检测：

分别以待检样品基因、标准样品基因作为模板，分别加入上述三对加尾引物，进行首轮巢式荧光定量PCR，得到首轮PCR产物；

分别以首轮PCR产物为模板，加入上述通用引物及三种TaqMan探针，进行二轮荧光定量PCR，并在每个循环的反应结束后采集荧光信号；

根据采集的荧光信号，计算待检样品的α1、α2珠蛋白基因拷贝数。

2.根据权利要求1所述的快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法，其特征在于：通用引物为随机组合的18～24bp寡核苷酸链，Tm值为58～64℃。

3.根据权利要求1所述的快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法，其特征在于：TaqMan探针序列的长度为22～24bp，5’端第一个碱基不为G，GC含量40～70%，Tm值比通用引物高5～10℃。

4.根据权利要求1所述的快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法，其特征在于：内参基因为看家基因β-actin。

5.根据权利要求1所述的快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法，其特征在于：加尾引物的各结合序列、基因特异识别序列之间随机插入1～3个核苷酸，减少序列位阻。

6.根据权利要求1所述的快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法，其特征在于：标准样品基因为α1和α2拷贝数均为2的正常基因组样品。

7.根据权利要求1～7任一项所述的快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法，其特征在于：所述通用引物为common-F和common-R，其序列为：

common-F：5’-ggcagcaccgacgtagac-3’（SEQ ID NO.1），

common-R：5’- gccgacgccactgtactc-3’ （SEQ ID NO.2）；

所述α1珠蛋白基因的加尾引物为α1-FT和α1-RT，其序列为：

α1-FT：5’-ggcagcaccgacgtagacAGcacgaactgacggccatcaagcacctctgtgtgtacttgtg

tgatg-3’ （SEQ ID NO.3），

α1-RT：5’-gccgacgccactgtactcctctgggaggtaggcagtcctct-3’ （SEQ ID NO.4），

所述α1珠蛋白基因的TaqMan探针：

α1-P：5’- Cy5-cacgaactgacggccatcaagc -BHQ2-3’ （SEQ ID NO.5）；

所述α2珠蛋白基因的加尾引物为α2-FT和α2-RT，其序列为：

α2-FT：5’-ggcagcaccgacgtagacATcctgaggtcaccgagctgcacTctcccctgcatccctttcag-3’ （SEQ ID NO.6），

α2-RT：5’-gccgacgccactgtactcAAtggcgcagagctgaatgaac-3’ （SEQ ID NO.7），

所述α2珠蛋白基因的TaqMan探针为α2-P，其序列为：

α2-P：5’- HEX - cctgaggtcaccgagctgcactc –BHQ1-3’ （SEQ ID NO.8）；

所述β-actin的加尾引物为β-actin-FT和β-actin-RT，其序列为：

β-actin-FT：5’- ggcagcaccgacgtagacAGTccatcaacttgcgtccacgctcagctcaggcaggaaa

gacac-3’ （SEQ ID NO.9），

β-actin-RT：5’-gccgacgccactgtactcacccagcacaatgaagatcaag-3’ （SEQ ID NO.10），

所述β-actin的TaqMan探针：

β-actin-P：5’- ROX- ccatcaacttgcgtccacgctc–BHQ2-3’ （SEQ ID NO.11）。