[发明专利]一种转基因定位整合的方法及其应用

权利要求书

1.一种变异的loxP元件，其特征在于，所述变异的loxP元件的序列如下所示：ataacttcgtata atgtatgc tatacgaaaggtg。

2.一种构建物，其特征在于，所述的构建物从5’到3’依次含有以下三个元件：

(a)权利要求1所述的变异的loxP元件；

(b)外源基因表达盒和/或筛选标记表达盒；

(c)如SEQ ID NO.:28所示序列的野生型loxP元件；或

(c)如SEQ ID NO.:28所示序列的野生型loxP元件；

(b)外源基因表达盒和/或筛选标记表达盒；

(a)权利要求1所述的变异的loxP元件。

3.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述的筛选标记为新霉素基因、或嘌呤霉素抗性基因。

4.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述的外源基因选自下组：溶菌酶基因、鲑鱼降钙素基因、或血清白蛋白基因。

5.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，元件(a)和元件(c)为同向排列。

6.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述的元件(a)和元件(c)为异向排列。

7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所述的构建物。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求2所述的构建物，或其染色体整合有一个或多个权利要求2所述的构建物，并且所述宿主细胞为体细胞。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为人或非人哺乳动物的细胞。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述的非人哺乳动物选自：山羊、绵羊、猪、牛、狗和兔。

11.如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为山羊成体体细胞、或山羊胎儿体细胞。

12.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是用选自下组的方法将权利要求2所述的构建物导入细胞的：同源重组法、显微注射法、电穿孔法、脂质体转染法、磷酸钙沉淀法、病毒感染法、或精子载体法。

13.一种制备转基因动物的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)在Cre重组酶存在的条件下，用权利要求7所述的载体转化一宿主细胞，从而获得一转化的细胞，其中，所述的宿主细胞为非人哺乳动物细胞并且是体细胞；

(ii)将转化的细胞再生为动物体，从而获得转基因动物。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(i)包括步骤：

(i-1)Cre酶表达载体与权利要求7所述的载体共转化所述的宿主细胞；或

(i-2)在具有细胞穿透活性的TAT-Cre重组蛋白的作用下，用权利要求7所述的载体对所述的宿主细胞的染色体进行基因整合。