[发明专利]介导整合的HIV‑1前病毒基因敲除的锌指核酸内切酶及其制法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及介导整合的HIV-1前病毒基因敲除的锌指核酸内切酶及其制法和应用。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由HIV感染引起的一种严重危害人们生命健康的传染性疾病。据WHO统计，全球艾滋病患者己超过5000万，每年新增患者500万，而每年死于艾滋病的人数约为300万。

目前，艾滋病临床治疗方法主要是高效抗逆传录病毒疗法(Highly active antiretroviral therapy，HAART)，该疗法不仅控制HIV复制，并且能重建AIDS患者的免疫功能，为AIDS的治疗打开了希望之门。但该疗法仅能抑制病毒复制，不能彻底清除病毒，其原因在于HIV感染细胞后，即可整合在宿主靶细胞染色体上形成前病毒(provirus)，并能随染色体的复制而遗传，不仅为病毒转录提供稳定模板，也为其逃脱机体免疫系统及药物攻击提供了避风港。

如何靶向清除整合在宿主靶细胞染色体上的HIV前病毒是目前HIV/AIDS治疗研究领域最富有挑战性、亟待解决的重大科学问题。目前本领域还没有针对该问题的有效手段，因此，本领域迫切需要开发一种定向清除靶细胞染色体上的HIV前病毒的方法，从而从根本上解决HIV/AIDS的治疗问题。

发明内容

本发明的目的就是提供一种介导整合HIV-1前病毒基因敲除的锌指核酸内切酶及其制法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种锌指核酸内切酶，所述的锌指核酸内切酶特异性地识别并切割整合于宿主染色体的HIV前病毒。

在另一优选例中，所述的宿主为人或非人哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述的锌指核酸内切酶为单体形式或二聚体形式，其中所述二聚体由二个锌指核酸内切酶单体所构成；较佳地所述的二聚体是异二聚体。

在另一优选例中，所述单体包括单体1和单体2，每个单体都具有识别元件和切割元件，并且所述单体1的识别元件识别HIV前病毒SEQ ID NO.：2所示的序列，所述单体2的识别元件识别HIV前病毒SEQ ID NO.：3所示的序列。

在另一优选例中，单体1的识别元件具有如SEQ ID NO.：10所示的氨基酸序列，和/或单体1的切割元件具有如SEQ ID NO.：6所示的氨基酸序列；和/或

单体2的识别元件具有如SEQ ID NO.：11所示的氨基酸序列，和/或单体2的切割元件具有如SEQ ID NO.：7所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述锌指核酸内切酶的单体还包括连接识别元件和切割元件的肽接头。

在另一优选例中，所述肽接头的长度为1-30个氨基酸残基，较佳地2-15个氨基酸残基，更佳地3-5个氨基酸残基。

在另一优选例中，所述的锌指核酸内切酶单体1和单体2是相同的或不同的。

在另一优选例中，在另一优选例中，所述的锌指核酸内切酶是异二聚体，所述的异二聚体能特异识别并切割整合于宿主基因组上的HIV前病毒的5′-LTR和3′-LTR序列。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的锌指核酸内切酶。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明的第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体还含有编码3Flag肽的核苷酸序列和/或编码核定位信号的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的载体为pUC表达质粒。

在另一优选例中，所述的载体具有如SEQ ID NO.：4或SEQ ID NO.：5所示的序列。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明的第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞，较佳地，所述宿主细胞为：Jurkat细胞、CHO细胞、COS细胞、293T细胞、RSF细胞等，更佳地为HIV感染的Jurkat细胞(较佳地HIV-1感染的Jurkat细胞)、293T细胞、T淋巴细胞、单核细胞、巨嗜细胞、少突胶质细胞，造血干细胞，树突状细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明第一方面所述锌指核酸内切酶的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，从而表达出第一方面所述的锌指核酸内切酶；和分离所述锌指核酸内切酶。