[发明专利]磷硫酰化DNA的酶促合成方法

权利要求书

1.一种磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，包括如下步骤：以DNA和L-半胱氨酸为底物，加入DNA磷硫酰化修饰酶蛋白或者含有DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的全细胞裂解液，在合适条件下发生磷硫酰化修饰酶促反应，获得磷硫酰化修饰的DNA。

2.根据权利要求1所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述全细胞裂解液的制备包括如下步骤：接种沙门氏菌(Salmonella enterica)serovar Cerro 87至LB培养基中，培养，收集菌体，用磷酸缓冲液洗涤所述菌体，用反应缓冲液重悬，冻融，超声破碎所述菌体，离心，取上清液，即获所述全细胞裂解液。

3.根据权利要求2所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述反应缓冲液包括20mM Tris-HCl、60mM KCl、10mM MgCl₂、1mM EDTA、2mM DTT、1mM PMSF和体积比为25％的甘油，所述反应缓冲液的pH为8.0。

4.根据权利要求2所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述酶促反应包括如下步骤：制备短链DNA-链霉亲和素复合体，向所述DNA-链霉亲和素复合体中加入所述全细胞裂解液，再加入终浓度为1mM的ATP、0.1mM的PLP和0.1mM的Cys，常规条件下反应，离心终止反应，用磷酸缓冲液洗涤反应物。

5.根据权利要求1所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的制备包括如下步骤：从沙门氏菌克隆DNA磷硫酰化修饰的酶蛋白基因，构建质粒表达载体，转化宿主细胞，诱导表达，裂解，镍柱亲和纯化，FPLC纯化，蛋白浓缩，即得所述DNA磷硫酰化修饰酶蛋白。

6.根据权利要求5所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述沙门氏菌为沙门氏菌(Salmonella enterica)serovar Cerro 87。

7.根据权利要求5所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述酶促反应包括如下步骤：取基因组DNA和所述DNA磷硫酰化修饰酶蛋白置于反应缓冲液，并加入终浓度为1mM的ATP、0.1mM的PLP和0.1mM的Cys，30℃下进行反应，加入苯酚氯仿抽提，抽提后的上清加入异丙醇沉淀，洗涤，干燥，即获磷硫酰化修饰的DNA。

8.根据权利要求7所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述反应缓冲液包括20mM的Tris-HCl和10mM的MgCl₂，所述反应缓冲液的pH为8.0。

9.根据权利要求7所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述各酶蛋白的重量份相同。

10.根据权利要求1所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述DNA的链长为30bp或4Mbp。