[发明专利]HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。

背景技术

传染性法氏囊病是危害世界养禽业的主要传染病之一。目前，对于传染性法氏囊病的防治仍是以传统疫苗为主，但是由于病毒抗原的不断变异，特别是超强毒株的出现，使得此病的防控形势更加严峻，而且现存的杆状病毒介导的外源基因在CHO细胞中的表达率较低。因此，研制新型、高效的基因工程疫苗来解决传统疫苗防治的弊端显得尤为重要。研究认为VP2蛋白是传染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要结构蛋白，也是宿主的保护性抗原。应用改进的重组杆状病毒表达系统在哺乳动物细胞中表达VP2抗原蛋白是新型禽类基因工程疫苗研制的关键性问题。

发明内容

本发明是要解决目前杆状病毒介导的外源基因在CHO细胞中的表达率较低的问题，提供HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。

HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行：

一、以质粒pMD18-T-VP2为模板，TZF-1和TZF-2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与pMD18-T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒pTZF-HA-VP2；

二、质粒pWK、pWK-I、pLM、pLM-I、pSD、pSD-I、pWKC、pLMC、pSDC和pTZF-HA-VP2分别进行EcoR I/Sal I双酶切，酶切后获得的目的片段pWK、pWK-I、pLM、pLM-I、pSD、pSD-I、pWKC、pLMC、pSDC分别与酶切后的pTZF-HA-VP2用T4DNA连接酶进行连接，九种连接产物经鉴定后获得九种重组转移载体，分别为pTZF-WK-HA-VP2、pTZF-WK-I-HA-VP2、pTZF-LM-HA-VP2、pTZF-LM-I-HA-VP2、pTZF-SD-HA-VP2、pTZF-SD-I-HA-VP2、pTZF-WKC-HA-VP2、pTZF-LMC-HA-VP2和pTZF-SDC-HA-VP2；

三、将九种重组转移载体分别转化E.coli DH10 Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒rBac-TZF-X；

四、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒rBac-TZF-X转染af9细胞，获得九种重组杆状病毒rBV-TZF-X，分别为rBV-TZF-WK-HVP2、rBV-TZF-WK-I-HVP2、rBV-TZF-LM-HVP2、rBV-TZF-LM-I-HVP2、rBV-TZF-SD-HVP2、rBV-TZF-SD-I-HVP2、rBV-TZF-WKC-HVP2、rBV-TZF-LMC-HVP2和rBV-TZF-SDC-HVP2，即完成HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建；

其中步骤一中引物TZF-1序列为5’-CCGGAATTCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC-3’；引物TZF-2序列为5’CGCGTCGACTTACCTTATGGCCCGGATTATGTCTTT-3’。

本发明通过构建了重组转移载体pTZF-WK-HA-VP2、pTZF-WK-I-HA-VP2、pTZF-LM-HA-VP2、pTZF-LM-I-HA-VP2、pTZF-SD-HA-VP2、pTZF-SD-I-HA-VP2、pTZF-WKC-HA-VP2、pTZF-LMC-HA-VP2和pTZF-SDC-HA-VP2，融合蛋白HA-VP2可在其内成功表达，且具有抗原性；这为进一步开发以本发明改造的杆状病毒转移载体为基础的基因工程疫苗奠定了基础。本发明还证实了添加调控元件WPRE可以提高杆状病毒介导外源基因在CHO细胞中的表达率，从而确定了重杆状病毒表达载体表达HA-VP2蛋白的强度。

附图说明

图1为具体实施方式一中SDS-PAGE鉴定HA-VP2蛋白的表达的电泳图，其中泳道1、2、3、4、5和6为经重组杆状病毒rBV-TZF-X侵染sf9昆虫细胞裂解物，泳道7为未经病毒侵染的细胞对照裂解物；

图2为具体实施方式一中SDS-PAGE鉴定HA-VP2蛋白的表达的电泳图，其中泳道8、9和10为经重组杆状病毒rBV-TZF-X侵染sf9昆虫细胞裂解物，泳道11为未经病毒侵染的细胞对照裂解物；