[发明专利]一种检测甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种检测甲型副伤寒沙门菌的逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)试剂盒。

背景技术

甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)是引起甲型副伤寒的病原菌，甲型副伤寒与伤寒在临床症状上非常相似，难以区分，均以急起高热为主要症状，是一种急性全身系统性传染病。该病传染性强，病程长，可反复发作，患者需住院隔离治疗，是我国《传染病防治法》中规定报告的乙类传染病之一，也是全球特别是发展中国家共同面临的公共卫生问题。

目前，甲型副伤寒沙门菌的传统检测方法为血分离培养及血清学诊断。血分离培养需时较长，约3-5天，且检出率易受病程，采血量及患者是否服用抗生素等因素的影响，难以达到快速的要求；血清学诊断存在特异性、准确性差的问题，临床上，单凭症状难以区分伤寒和副伤寒。因此有必要开发灵敏的早期检测方法。目前，随着抗生素的广泛应用和病原体本身耐药、变异等诸多因素的影响，近年甲型副伤寒的复发率增高，临床表现很不典型，给早期临床诊断和治疗带来很大的困难。

随着分子生物学的发展，目前已有多种PCR方法用于甲型副伤寒沙门菌的检测，虽在灵敏度方面有所改进，但由于需要精密仪器的配套使用，同样也无法满足基层和现场检测的需求。

环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isotherm amplification，LAMP)是由Notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和两对特殊的引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。

近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人(2004)根据LAMP的原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-CoV，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(2007)建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。

LAMP还可以检测细菌、真菌等病原微生物，其灵敏度和特异性都有很好的体验。但目前尚未见该方法在甲型副伤寒沙门菌检测中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)的特异性RT-LAMP引物组。

本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的LAMP检测试剂盒。

为实现上述目的，通过对分离到的48株甲型副伤寒沙门菌hsdM基因和NCBI已报道的hsdM基因序列比对，通过BLAST软件进行序列同源性分析，找到特异性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测甲型副伤寒沙门菌的靶序列。

进一步，本发明还提供用于特异性扩增上述靶序列的引物组合。

本发明提供用于检测甲型副伤寒沙门菌的特异性RT-LAMP引物组合，包括以下6条引物：

F3：5’-CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’；

B3：5’-GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’；

FIP：5’-CCAATAGAAATCCTCGGCCAG-

     CCGAGTTTTGATAAGGATGATTG-3’；

RIP：5’-A ACCCTTCAAAACTACCAAGTCC-

    GAATCTTTAACACGCAACTTTC-3’；

LF：5’-TGAGGTTGGATTCCAT-3’

LB：5’-ATTGAGTGGGTTAACAAA-3’

本发明提供了上述引物组在制备甲型副伤寒沙门菌的检测试剂盒或检测试剂中的应用。

本发明提供了一种含有上述6条引物的检测试剂。

本发明提供了一种含有上述6条引物的甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP检测试剂盒。