[发明专利]一种检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医用检测试剂盒，具体涉及一种基于线粒体DNA T10609C单核苷酸多态性检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒。

背景技术

高原红细胞增多症(high altitude polycythemia, HAPC)是由高原低氧引起的以红细胞过度代偿性增生为主要特征的临床综合症【Velarde FL，Consensus statement on chronic and subacute high altitude diseases，《High Alt Med Biol》，2005，6：147-157】。由于红细胞异常增多，血液粘滞度显著增高，微循环障碍，引起全身各脏器、组织广泛损害，严重者可因血管栓塞而猝死。文献报道，在海拔3000米～4700米高原地区，HAPC的发病率为2.43％～37.5％，是高原居民中发病率最高、危害最大的的慢性高原病。HAPC的发病具有明显的种族差异和个体易感倾向，提示HAPC与遗传因素有密切关系【，Heights and haematology: the story of haemoglobin at altitude，《Postgrad Med J》，2007，83：148-151】。

高原环境影响机体的主要因素是缺氧，机体对高原低氧环境的习服也是围绕着氧的摄取－运输－利用这条轴线来进行的。线粒体是机体能量代谢的中心，是组织、细胞氧利用的关键场所，机体耗能的90％以上来自于线粒体的氧化磷酸化作用。线粒体作为细胞的‘动力工厂’，在低氧引起细胞损伤和组织、细胞对低氧环境的习服过程中的作用都是至关重要的【高文祥，低氧大鼠脑线粒体体外转录活性的研究，《中国应用生理学杂志》，2001；17: 323- 326】。因此，线粒体在HAPC的发生中起着重要的作用。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是一种新型的分子遗传标记，广泛用于复杂疾病的易感性预测【Kato， Mitochondrial DNA polymorphisms in bipolar disorder，《J Affect Disord》，2001，62: 151-164】。

高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting analysis，HRM）是基于核酸的物理性质，通过高分辨率的实时监测升温过程中双链DNA荧光染料(LCGreen、SYTO 9和Evagreen)与PCR扩增产物的结合情况来实现的。不同SNP位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的形状。因此，根据熔解曲线的形状，HRM分析就能够有效区分DNA的碱基变化，进行基因分型。分型原理如下：

（1）本技术方案在具有高分辨率的Rotor-gene 6000 PCR-HRM仪上完成。软件设置的程序包括两个连续的部分，先通过PCR（聚合酶链反应）获得含有待检测突变位点DNA片段，然后立即进行HRM基因分型，经仪器自带软件分析得出分型结果；

（2）检测结果表明，熔解曲线形状与危险型对照DNA一致的待测样本，其线粒体DNA 10609位点碱基为T；熔解曲线形状与保护型对照DNA一致的待测样本，其线粒体DNA 10609位点碱基为C（见图1）。

HRM技术与传统的基因分型手段相比有多项优势：

（1）操作简单：和目前的PCR技术基本一致，无需序列特异性探针，不受碱基位点局限，真正实现了闭管操作，避免了交叉污染的可能性，对技术人员没有特殊的专业要求。

（2）高效：灵敏度和特异性都非常高，达到近100%。

（3）通量大而快：依据仪器的情况，最多一次可以同时上样384个样本，并在60-90分钟内完成检测。

（4）廉价：试剂与普通荧光定量PCR基本一致，并且HRM与PCR同时进行，无需额外的试剂和仪器。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于线粒体DNA T10609C单核苷酸多态性检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒，能用于高原红细胞过度增多易感者的筛选，指导高原红细胞过度增多的预防。