[发明专利]瓠瓜抗疫病基因片段或基因标记及应用

说明书

技术领域

本发明是借助于抗病基因同源序列方法，克隆瓠瓜抗疫病基因片段或者转化为分子标记等，主要涉及瓠瓜常规杂交育种，利用分子标记辅助育种，抗疫病基因的定位及分子作图，抗疫病基因的克隆以及抗病基因的调控机理分析等方面，属于植物生物技术科学领域。

背景技术

疫病是瓠瓜生产上最重要的病害之一。主要为害瓠瓜的茎、叶及果实。茎部染病：多在茎基部或嫩茎节部产生暗绿色水渍状斑，后变软缢缩，造成病部以上的叶片萎蔫或枯死。叶片染病：产生圆形至不规则形水渍状大病斑，叶片软腐下垂，干燥条件下呈青白色至浅褐色薄纸状，易破裂。果实染病：产生水渍状暗绿色斑，逐渐缢缩凹陷，连续阴雨或湿度大条件下长出稀薄的灰白色霉状物，即病菌的孢囊梗和孢子囊。该病扩展速度极快，病部易腐烂，散发出腥臭味。        病菌以菌丝、卵孢子、厚垣孢子随病残体在土壤或种子中越冬，翌年条件适宜时产生孢子，借风、雨、灌溉水传播到瓠瓜等的茎基部或近地面的果实上，进行初侵染，几天后病部又产生大量孢子囊，遇水后释放出游动孢子进行多次再侵染，使疫病迅速扩展，气温20-30℃，雨日多、雨量大、持续时间长，或田间湿气滞留很易造成该病大流行。疫病严重影响了瓠瓜植株的正常的生长发育过程，给生产带来极大的经济损失。抗病基因的利用及抗病育种是瓠瓜病害防治最有效的方法。

二十世纪四十年代， Flor提出了经典的“基因对基因”理论学说，即植物和病原菌体内各自存在一个显性基因，植物抗病基因或病菌无毒性（Avr）基因的缺失或改变都能引起病害的产生。这个模型适用于大多数活体营养型病原菌，包括病毒、细菌、真菌和线虫类。“基因对基因”抗病性一般是受体被作为模型：植物抗病蛋白能够直接或间接的识别源自病菌的Avr产物。一旦这种识别发生，就会引起防御反应。大多数抗病基因（R）触发的抗性与快速防御反应相关，称为过敏性反应（hypersensitive response; HR）。而目前，大多数抗病基因的产物都含有蛋白识别的结构域，如富含亮氨酸的重复单位（LRR）的结构域或卷曲螺旋（CC）的结构域；信号转导结构域，如核苷酸结合部位（NBS）或蛋白激酶（PK）结构域。一些抗病基因产物被预测为细胞质蛋白，而另一些通过一个跨膜结构域（TM）贯穿细胞膜。这些结构域组合能够产生不同类型的R蛋白。根据结构的特性已经鉴定出至少六种不同类型的R基因：1）NBS-LRR, 2）LRR-TM-PK, 3）LRR-TM, 4）CC-TM, 5）PK, 6）PK-PK。其中，NBS-LRR类抗病基因是植物体内存在的最大一类抗病基因；这些抗病基因在结构上的保守性为我们利用抗病基因同源序列法克隆其他作物的抗病基因带来了潜在可能。在已知分离获得的抗病基因中，小麦抗叶锈病基因Lr10和马铃薯抗马铃薯Ｘ病毒基因Rx2就是利用抗病基因同源序列法克隆抗病基因的经典例子，说明利用该法克隆抗病基因是可行的。

发明内容

技术问题  

本发明的目的是提供一种通过抗病基因同源序列法快速鉴定瓠瓜疫病基因片段或者分子标记及应用。结果一方面可用于瓠瓜抗疫病分子标记辅助选择育种，另一方面也为抗疫病基因的克隆提供参考依据。

技术方案

本发明是前期对大量瓠瓜种质资源进行抗病性筛选，获得高抗瓠瓜疫病抗病种质的基础上，应用抗病基因同源序列法克隆抗疫病基因片段，通过与已知抗病基因同源性分析，序列比对等方法确认；为开发相应的分子标记和利用cDNA末端快速扩增技术获得抗病基因的全长奠定基础。

为了实现上述目标，本发明采用抗病基因同源序列法对瓠瓜抗疫病基因进行克隆，获得了抗疫病基因片段或者基因标记3个，片段大小分别为510bp、498bp和501bp。以该基因片段序列为基础，开发相应的分子标记，可以进行瓠瓜抗疫病分子标记辅助选择育种；同时利用基因片段或者基因标记进行新的种质资源的创新；结合已有的分子标记可以实现瓠瓜抗疫病基因的分子作图；利用这些基因片段，通过设计基因特异引物，采用cDNA末端快速扩增技术分离瓠瓜抗疫病基因，为通过基因工程改良瓠瓜的抗病性奠定基础；也为最终解析瓠瓜抗疫病基因的分子机理提供了基因资源。

本发明的积极效果：

1） 有利用快速开发与抗病基因紧密连锁的分子标记。通过鉴定的瓠瓜疫病基因，开发相应的共分离功能性标记（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子标记辅助选择，准确性高。