[发明专利]水貂巴氏杆菌病蜂胶灭活苗

说明书

技术领域

本发明涉及一种以蜂胶为佐剂的水貂巴氏杆菌病灭活疫苗及其制备方法，属于兽医生物制品技术领域。

背景技术

巴氏杆菌病主要是由多杀性巴氏杆菌及溶血巴氏杆菌引起的畜、禽、野生动物和毛皮动物的细菌性出血性、败血性传染病。本病分布广泛，世界各地均有发生。近几年水貂巴氏杆菌亦有流行，它发病率高、死亡率高，对毛皮动物饲养业危害很大，经常造成严重的经济损失。

目前我国对水貂巴氏杆菌病主要采用是抗生素药物治疗，但药物治疗存在一定的缺陷，一旦停药容易复发，而且容易产生抗药性。防治该病发生的有效措施是研制相应的疫苗。

为增强疫苗的免疫源性，常在灭活菌疫苗的研制中加入免疫佐剂。免疫佐剂是一种免疫调节剂，可以先于抗原或与抗原混合或同时注入动物体内，能特异性地增强抗原的免疫原性，提高免疫效果。免疫佐剂可增强抗原所激发的抗体应答, 可提高免疫原性, 以及增强吞噬细胞的非特异性杀伤功能和特异性细胞免疫的刺激作用等。因此,佐剂是疫苗特别是灭活疫苗所必不可少的成分。蜂胶作为一种具有生物活性的免疫佐剂所显示出的优点已逐渐被认识。蜂胶具有广谱生物学活性, 是一种良好的免疫增强剂和刺激剂, 它既能引起特异性免疫应答, 又能启动非特异性防御机制, 有增强免疫抗体生成和提高白细胞吞噬能力的明显效果，使用该佐剂后可以有效保护皮毛质量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以蜂胶为佐剂的水貂源巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，使其免疫水貂后副作用小，对毛皮质量影响小，免疫产生时间早，免疫力强，免疫期长。

具体实施步骤：

1.水貂源巴氏杆菌灭活原液的制备。

1）取水貂源的多杀性巴氏杆菌接种血琼脂斜面，37℃培养24小时，经检验纯正，作为菌种使用；

2）以适量的菌种培养物接种血琼脂斜面，经37℃培养18-24小时，收取培养物进行检验；

3）取培养菌液加入甲醛溶液，使其含甲醛的最终浓度为0.4%，37℃摇床灭活24小时。

2.蜂胶溶液的制备：选取已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的乙醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4℃下保存备用。

3. 成品疫苗制备：按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8-15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15-20分钟，使其充分混合乳化。

4.作为本发明水貂巴氏杆菌病蜂胶灭活苗的制备方法的优选实施方式，步骤1的3)中，在灭活后还可以对巴氏杆菌培养液进行灭活检验和毒素检验。进行灭活检验和毒素检验的作用在于对制造过程疫苗质量的控制。

本发明的巴氏杆菌为购自中国兽医药品监察所菌种室的一株多杀性巴氏杆菌C52-17作为生产疫苗的菌株，血清型A：1,  2008.4.冻干，有效期10年。

具体实施方式

实施例1：

疫苗制备：本品是选用本发明人于中国兽医药品监察所菌种室购买的一株多杀性巴氏杆菌C52-17作为生产疫苗的菌株,复苏后接种血琼脂斜面培养基18小时，镜检无杂菌后作为种子液，以适量的菌种培养物接种血琼脂斜面经37℃培养18-24小时，取培养菌液加入甲醛溶液，使其含甲醛的最终浓度为0.4%，37℃摇床灭活24小时。

疫苗灭活检验：将甲醛灭活后的菌液取100微升接于3ml液体培养基中，一次培养取三次样，每个样品接种于三个试管中观察五天进行灭活安全检验，五天后接种的液体培养基仍澄清无混浊则安全检验合格。

成品疫苗制备：按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8-15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15-20分钟，使其充分混合乳化。

实施例2

将实施例1制备好的三批疫苗单剂量、单剂量重复和超剂量注射健康水貂，后肢内侧肌肉接种。通过14d观察，接种水貂体温和食欲正常，接种局部无肿胀和炎症，未出现局部和全身反应：每批疫苗选择3只，剖杀后切开注射部位皮肤观察注射局部病理变化，水貂接种部位皮下无异常变化，后肢内侧肌肉接种部位肌肉组织正常，仅见到注射部位呈深褐色，有玉米粒大小，与周围红褐色肌肉相区别，注射部位未见炎症反应。60-70日龄貂继续观察至接种后30d，貂发育良好。说明疫苗对不同年龄的水貂具有较好的安全性。

实施例3

三批水貂巴氏杆菌病蜂胶灭活疫苗分别免疫16-18g小白鼠20只，实验组和对照组各10只，0.2mL/只，免疫后21d连同对照组小白鼠20只分别用巴氏杆菌攻毒，观察7日，三批疫苗免疫组小白鼠均80%获得保护，对照组小白鼠均100%发病。