[发明专利]一种水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗及制备工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种疫苗及其制备方法。

背景技术

水貂出血性肺炎又称水貂假单胞菌性肺炎，是主要发生在每年8-11月份水貂换毛季节的一种急性传染病，以出血性肺炎、急性死亡为特征，死前出现呼吸困难、鼻孔流出红色带泡沫液体等症状，死后剖检可见整个肺叶肿大并有弥漫性出血和败血症变化。本病世界各地均有发送，每年可造成养殖场20%-40%的死亡率，是危害水貂养殖业的中药细菌性传染病。

该病病原为假单胞菌科（Pseudomonadaceae）假单胞菌属（Pseudomonas）中的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginolsa），亦称为绿脓杆菌（Bacterium pyocyaneum）,为革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，一端有一根鞭毛，能运动。不能形成芽孢及荚膜。在普通琼脂培养基上生长良好，形成大小不一的菌落。多数能产生色素，使菌落周围琼脂培养基着色。

绿脓杆菌广泛分布于土壤、水和空气中，在正常人与动物肠道和皮肤上亦有存在，也易从外伤、烧伤及尿道感染等发现，能引起人的烧伤感染和患囊性纤维化病人的肺部感染，具有多种致病因子而且有强侵袭力。

水貂出血性肺炎发病急，死亡快，发病时往往来不及治疗，常用药物替米考星、阿奇霉素、卡那霉素治疗效果不显著，而且抗生素的滥用导致绿脓杆菌已产生耐药性，因此需要有效的疫苗来预防，国外有报道将细菌细胞壁提取物（JAMES E.PENNINGTON,1979）加类毒素成分弹性蛋白酶制成免疫原，有一定的免疫效果，但制备过程复杂，成本高，不适合大量生产使用，而且免疫次数多，免疫期短，不适合临床应用，绿脓杆菌抗原型繁多，单一成分的细胞提取物往往很难达到很好的保护效果。

发明内容

步骤1：将铜绿假单胞菌菌株Pa1株和铜绿假单胞菌菌株Pa3株分别接种于发酵培养基培养，调整菌数为200-250亿CFU/mL按比例1：1混合；

步骤2：灭活步骤1所得混合培养物；

步骤3：在步骤2所得培养物中添加蜂胶佐剂，即得所述水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗。

作为优选，步骤1所述接种为按发酵培养基体积的2%接种菌株。

作为优选，步骤1所述培养为在37℃通气搅拌培养12-16h，控制绿脓杆菌的培养时间在16h以内，防止培养时间过长导致绿脓杆菌外毒素的产生，更好地保障疫苗安全性。

作为优选，步骤2所述灭活为用终浓度0.5%的甲醛灭活，于37℃灭活24h。

作为优选，步骤3所述佐剂为蜂胶溶液。

本发明所述铜绿假单胞菌菌株Pa1株和Pa3株混合制成的水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗，一次可达到80%以上保护率，免疫期可达到五个月，其制备工艺简单，适合商品化生产，具有良好的应用前景。

本发明的绿脓假单胞菌（铜绿假单胞菌）购自中国兽医药品监察所菌种室，分别为绿脓假单胞菌（铜绿假单胞菌）Pa1， 2007.7.10.冻干；绿脓假单胞菌（铜绿假单胞菌）Pa3， 2007.7.10.冻干。

具体实施方式

发酵培养基：蛋白胨2%，牛肉膏0.6%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.5%，用去离子水配成，配完调pH值7.4-7.6,112℃ 30min，灭菌后按照培养基的2%加入健康胎牛血清。

实施例1

疫苗制备：将中国兽医药品监察所菌种室购买的铜绿假单胞菌菌株Pa1株和Pa3株用营养肉汤溶解后，分别接种于斜面培养基上，37℃培养24小时，取培养物分别划线接种于含十六烷三甲基溴化铵的平板上，37℃培养16-18小时，经纯检合格后，作为一级种子，分别接种于含0.3%牛肉膏和2%胎牛血清的营养肉汤培养基，37℃培养16-18小时，取样经纯粹检验合格后，作为二级种子，将二代种子按2%比例接种于发酵罐，按发酵罐容积总量装入70%的发酵培养基与0.01%的消泡剂，搅拌速度为150转/分，37℃培养16-18小时，即为培养好的疫苗菌液，分别取样用适宜培养基进行纯粹检验，同时取样进行活菌计数，调整每种菌液含活菌数为200-250亿CFU/mL，之后将菌液按菌株Pa1株和Pa3株比例为1:1混合，混合后加终浓度为0.5%的甲醛37℃灭活24h。

疫苗灭活检验：将甲醛灭活后的菌液取100微升接于3ml液体培养基中，一次培养取三次样，每个样品接种于三个试管中观察五天进行灭活安全检验，五天后接种的液体培养基仍澄清无混浊则安全检验合格。