[发明专利]一种污染土壤遗传毒性的原位检测方法

权利要求书

1.一种污染土壤遗传毒性的原位检测方法，其特征在于：土壤样品不需固液萃取和分离，而直接利用检测遗传毒性的生物传感细胞进行检测，包括如下步骤：

步骤1：生物传感细胞的培养与准备：将生物传感细胞接种至新鲜培养基培养，使其达到对数增长期，得到细胞悬浊液；

步骤2：土壤样品的准备：将土壤样品风干、研磨过10目筛后，称取预设质量的样品，与预设体积的去离子水混合，制备土壤样品悬浊液；

步骤3：样品遗传毒性测试：将步骤1中制备的细胞悬浮液与步骤2制备的土壤样品悬浊液混合，使用能够读取化学发光的发光检测仪或多功能酶标仪，每隔5-30min读取并记录混合液的化学发光值lum；

步骤4：数据处理：对于待测土壤样品，定义诱导倍数(IR)＝某一时刻污染土样的发光强度/相同时刻阴性对照土样的发光强度；若显著性检验IR＞1，则认为该土壤样品具有遗传毒性；在相同剂量下，IR越高，土壤样品的遗传毒性越强；在相同IR下，称取的土壤剂量越小，土壤样品的遗传毒性越强。

2.根据权利要求1所述的原位检测方法，其特征在于：步骤1所述的生物传感细胞为重组发光菌，在暴露于遗传毒性物质时，产生相应的发光增强现象。

3.根据权利要求2所述的原位检测方法，其特征在于：所述重组发光菌为Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux。

4.根据权利要求3所述的原位检测方法，其特征在于：所述重组发光菌为Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux已于2009年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2925，该保藏中心 简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

5.根据权利要求1所述的原位检测方法，其特征在于：步骤2所述的土壤样品的准备，对土壤样品悬浊液进行超声处理，使土壤颗粒进一步分散在悬浊液中。

6.根据权利要求5所述的原位检测方法，其特征在于：所述超声处理时间为200-300s，超声波的频率为38-40kHz。

7.根据权利要求1所述的原位检测方法，其特征在于：步骤2所述的土壤样品质量在5mg至500mg之间，按照土水重量比1∶20最终定容。

8.根据权利要求1所述的原位检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1：生物传感细胞的培养与准备：

从含有10mg/L卡那霉素的LB平板LBAKM10中挑取一个重组发光菌Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux单菌落，接种于含有10mg/L卡那霉素的LB培养基LBKM10中，30℃于150rpm摇床中过夜培养16h，离心后重悬，用新鲜LBKM10培养基将细菌稀释10倍以获得细胞悬浊液，待用；

步骤2：土壤样品的准备：

配制浓度为20mg/L、2mg/L、0.2mg/L、0.02mg/L的丝裂霉素C溶液，各浓度梯度分别取1ml与5g无污染土壤混合，自然风干，得到丝裂霉素C最终浓度为4mg/kg、0.4mg/kg、0.04mg/kg、0.004mg/kg的污染土壤；分别称取250mg污染土壤样品，按照土水重量比1∶20混合，得到土壤样品悬浊液。

步骤3：样品遗传毒性测试：

将步骤2得到的不同MMC浓度的土壤样品悬浊液置于频率为38-40kHz的超声清洗仪中，施加超声300s，得到不同MMC浓度的土壤样品待测液；取198μL步骤1中稀释的细胞悬浊液，加入黑色底透的96孔酶标板孔内，再向每个 孔中加入2μL不同MMC浓度的土壤样品待测液，每种土壤样品待测液做3组平行样，使用能够读取96孔酶标板化学发光和吸光度的多功能酶标仪，每隔30min读取并记录37℃温度条件下96孔板中每一个孔的化学发光及600nm的吸光度，两次测量间隔96孔板在37℃培养箱中培养。

步骤4：数据处理

诱导倍数IR＝暴露3小时时刻污染土样的发光强度/相同时刻空白土样的发光强度。