[发明专利]一种无动力源无阀型单分子检测芯片及应用

权利要求书

1.一种无动力源无阀型单分子检测芯片，由反应层（1）、修饰层（2）、封接层（3）、主通道（4）、反应小室（5）、进样口（6）、出样口（7）和耐热胶带（8）构成，反应层（1）由主通道（4）串联反应小室（5）组成，反应小室（5）位于主通道（4）上方或下方，进样口（6）、出样口（7）位于主通道（4）两端，修饰层（2）与封接层（3）连接，反应层（1）通过修饰层（2）与封接层（3）封接后组成微流控芯片组件，耐热胶带（8）粘贴于反应层（1）的上表面。

2.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片，其特征在于，反应小室（5）位于主通道（4）上方时，封接层（3）与反应层（1）封接前，预先在基底上铺展与反应层（1）材料相同的具有透气性质的聚合物薄膜作为修饰层（2）。

3.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片，其特征在于，反应小室（5）位于主通道（4）下方时，封接层（3）与反应层（1）封合前，二者分别用空气等离子体进行处理。

4.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片，其特征在于，主通道（4）的宽度100 nm-5 mm，主通道的深度范围100 nm-1 mm，反应小室（5）的体积为微升到皮升级别。

5.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片，其特征在于，反应层（1）的制作材料选用聚合物材料。

6.根据权利要求5所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片，其特征在于，反应层（1）的制作材料选用聚二甲基硅氧烷。

7.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片，其特征在于，反应小室（5）位于主通道（4）上方时，封接层（3）的材料选用玻璃和单晶硅片作为基底；反应小室（5）位于主通道（4）下方时，封接层（3）的材料选用透明胶带、PET膜或氟膜。

8.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片在进行实时荧光定量聚合酶链式反应中的应用，通过以下步骤实现：

（1）将模板DNA/RNA核酸扩增试剂混合；

（2）预先将微流控芯片置于抽气容器中，进行抽真空除气处理；

（3）微流控芯片置于抽气容器中抽真空除气后，取出芯片，迅速粘附透明耐热胶带（8）；

（4）刺破芯片进样口（6）处的胶带，将样品溶液加入进样口（6）处，样品溶液在主通道（4）和反应小室（5）与外界的气压差的驱动下均匀充满整个主通道（4）和反应小室（5）；

（5）待样品溶液均匀充满整个主通道（4）和反应小室（5）后，紧接着在样品的进样口（6）处加入与水不相容的油相液体；

（6）与水不相容的油相液体在内外气压差的驱动下进入主通道（4），将主通道（4）中的样品溶液冲入后续的反应小室（5），直至样品进入所有的反应小室（5），从而将反应样品封隔入反应小室（5）内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化；

（7）待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道（4）后，用耐热胶带（8）将进样口（6）和出样口（7）封闭；

（8）将上述微流控芯片置于实时荧光定量PCR仪等核酸扩增装置上，采用电荷耦合元件图像传感器，在每一轮的PCR反应结束时，采集每个反应小室（5）在该轮反应的荧光信号，并最终绘制成反应过程的荧光信号曲线，反应结束后，通过对反应过程中指数期荧光信号的分析对核酸进行定量。

9.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片在进行数字核酸扩增中的应用，通过以下步骤实现：

（1）将模板DNA/RNA与带有荧光染料的核酸扩增反应试剂混合：

如果核酸扩增采用荧光定量PCR方法，则将模板DNA/RNA与Taqman探针核酸扩增试剂、SYBR核酸扩增试剂混合；

如果核酸扩增采用等温扩增，则将模板DNA/RNA与等温扩增反应试剂及DNA荧光染料SYBR GreenⅠ、钙黄绿素、FITC混合；

（2）预先将微流控芯片置于抽气容器中，进行抽真空除气处理；

（3）微流控芯片置于抽气容器中抽真空除气半小时后，暂停抽真空除气，将微流控芯片迅速取出在其上粘附透明耐热胶带（8）后，再将微流控芯片迅速置于抽气容器中继续抽真空除气操作；

（4）微流控芯片抽真空除气操作完成后，迅速取出微流控芯片置于常压下，刺破进样口（6）处的胶带，将样品溶液加入进样口（6）处，样品溶液在主通道（4）和反应小室（5）与外界的气压差的驱动下均匀充满整个主通道（4）和反应小室（5）；

（5）待样品溶液均匀充满整个主通道（4）和反应小室（5）后，紧接着在样品的进样口（6）处加入与水不相容的油相液体；

（6）与水不相容的油相液体在内外气压差的驱动下进入主通道（4），将主通道（4）中的样品溶液冲入后续的反应小室（5），直至样品进入所有的反应小室（5），从而将反应样品封隔入反应小室（5）内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化；

（7）待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道（4）后，用耐热胶带（8）将进样口（6）和出样口（7）封闭；

（8）将上述微流控芯片置于原位PCR仪的温控装置上，进行核酸扩增；若对核酸进行等温扩增，将微流控芯片组件置于普通的热板上进行核酸扩增反应即可；

（9）反应结束后，采用电荷耦合元件图像传感器采集反应小室（5）的荧光信号，每一个发出荧光强度大于阈值的小室代表一个阳性核酸扩增反应，通过对阳性反应小室（5）的计数，就可以实现对所检测样品的原始拷贝数进行绝对定量。