[发明专利]一种采用多手段提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生态学技术领域，具体涉及一种桑园土壤微生物总DNA的提取方法。

背景技术

长期以来，有关土壤微生物的多样性研究是通过分离培养来实现的。然而，绝大多数微生物种群尚不能实现纯培养，这成为土壤微生物多样性研究的一个限制性因素。随着土壤微生物群落结构研究的不断深入，借助现代分子生物学技术的研究方法如PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-DGGE等避免了传统研究方法不能全面获取土壤微生物多样性信息的缺陷，可以通过土壤微生物DNA表现出的多样性，真实地反映上壤微生物种群结构情况，而土壤微生物群落基因组总DNA的高效、高品质提取，是从分子生物学水平对土壤微生物群落结构进行研究的前提条件。由于土壤理化成分复杂，常含有腐殖酸、酚类化合物、重金属离子等影响DNA分子操作的物质，土壤样品处理和实验条件较复杂，耗时长，以致从土壤环境中获得高纯度微生物基因组DNA具有一定难度，DNA提取技术创新因此备受关注。目前已经报道了多种土壤微生物总DNA提取方法。从土壤提取微生物总DNA的方法大致分为两类：直接提取法和间接提取法。间接法提取的DNA纯度高，但其缺点是得到的细菌只占总菌群的25％～50％，而直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60％。直接法由于能够提取到较全的细菌DNA、省力、DNA产量高，因而发展很快。Tsai等使用SDS和溶菌酶裂解细胞提取总DNA，Tiedje等使用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)去除腐殖酸，效果很好，Bourrain等人采用该方法从活性污泥中提取了DNA，Reddy等人从堆肥中提取了DNA。

桑园土壤微生物的多样性及生命活动与桑园上壤结构的形成和改良、土壤肥力演变、桑树根部病害的发生、桑树营养物质供给和植株生长发育等密切相关，但目前尚未见应用免培养法研究桑园土壤微生物多样性的报道。

发明内容

本发明是基于建立桑树根围土壤微生物群落结构的分子生态学试验技术体系，借鉴已有的土壤微生物总DNA的提取方法，提供一种高效的可直接用于PCR分析的桑园土壤微生物总DNA提取方法。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：

一.材料选择

供试土壤于2011年3月7日采自湖北省农业科学院经济作物研究所生产桑园(东经114°19′，北纬30°29′，海拔29m)的桑树根围，桑树品种为湖桑32号。采集土壤为黄粘土，采样深度为5～10cm表土层，按5点法取样，混匀后放入无菌袋中，4℃保存，24h内完成土壤微生物基因组总DNA的提取。

二.试剂选择

本发明采用的主要试剂中：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基磺酸钠(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30)、聚乙二醇8000(PEG8000)、脲、去离子甲酰胺均购自华美生物工程有限公司；溶菌酶、蛋白酶均购自Sigma公司；硝酸银购自中国人民解放军第九五零九工厂；λDNA/HindIII digest DNA Marker、2000DL DNA Marker和Taq HS均购自大连宝生物工程有限公司；16SrDNA通用引物由上海英骏生物工程有限公司合成；土壤提取试剂盒Soil DNA Kit(50)购自Omega公司。

三.土壤微生物总DNA直接裂解方法

方法一CTAB-蛋白酶-SDS-反复冻融法

取5g土样，向其中加入13.5mL DNA提取液I(Tris-HCl 100mmol/L，EDTA 100mmol/L，Na₃PO₄ 100mmol/L，NaCl 1.5mol/L，1％CTAB；pH 8.0)和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min；再加入20mg/mL蛋白酶K15μL，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴1h；反复冻融3次，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)再次抽提，8500r/min离心10min，取上清液，备用。

方法二PVP预处理-CTAB-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反复冻融法