[发明专利]一种获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及获得兰科植物种子萌发有效共生真菌的方法，具体来说涉及一种在兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)原生地诱导种子萌发，获得原球茎，再从原球茎中分离、培养和筛选出对种子萌发有效共生真菌的方法。

背景技术

兰科植物的种子非常细小，仅有发育不完全的胚，在自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质。目前兰科植物种子的萌发，多采用人工培养基在无菌条件下进行非共生萌发，萌发率虽高，但在进行濒危种类野外回归时，幼苗移植到自然环境中存活率较低，并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受限。通过种子和其有效萌发真菌在自然条件下的共生萌发能很好的解决这一问题。有效真菌的获得目前多采用从兰科植物野生植株的根中分离。但由于兰科植物根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得种子萌发有效真菌的筛选和分离变得复杂而繁琐。同时，不同兰科植物根中的真菌与种子萌发阶段的有效共生真菌是否相同目前仍不确定。因此，获得种子萌发的有效共生真菌是开展珍稀濒危兰科植物回归的关键环节。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法，为实现兜唇石斛的野外回归创造条件。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

本发明的技术方案主要是基于以下认识。

我们将兜唇石斛的种子放入特制的种子袋中，并将种子袋放置在有兜唇石斛植株生长的原生地，诱导种子萌发产生原球茎，将获得的原球茎表面灭菌后在无菌条件下用人工培养基培养，诱导原球茎中的内生真菌生长，待长出菌丝时，进行真菌的纯化，获得纯菌落，并进行真菌的分子鉴定和保存。将获得的真菌和兜唇石斛的种子进行共生萌发培养，设置对照实验，以检验所获得的真菌对兜唇石斛的种子萌发的有效性，结果表明所获得的真菌是兜唇石斛种子萌发的有效共生真菌，从而实现了本发明的目的。

一种获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法，包括以下步骤：

(1)在兜唇石斛花期进行人工异交授粉，果实成熟但果荚尚未裂开时收获果实，将种子干燥后置于无菌的密闭玻璃容器中在-20℃条件下保存，待用；

(2)用灭菌的镊子将100～200粒兜唇石斛的种子播种在尼龙网布上，将播好种子的尼龙网布对折，用热封机将三边封起来，制作完成种子袋，在种子袋边缘缝上标签，便于监测和回收；

(3)选择有兜唇石斛成年植株自然生长的不同地点，将种子袋固定放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的树干上，在种子袋上面覆盖一层苔藓保湿；

种子袋放置时应尽量靠近成年植株根部，并使种子袋呈水平状态，避免种子在重力作用下聚集成团。

(4)每个月定期从各放置点回收2～3个种子袋，检查种子袋内种子的萌发情况，当发现有原球茎时，回收所有的种子袋；

(5)将回收的原球茎依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗后切成两半，切口面贴于马铃薯葡萄糖培养基PDA上进行培养；

(6)原球茎切口处长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的PDA培养基上，转移3～5次后，得到纯菌落；

(7)将兜唇石斛的种子放入无菌水中制成均匀的悬浮液，在配制好的燕麦琼脂培养基(OMA)的培养皿表面放置两张无菌滤纸，分别吸取150微升的种子悬浮液均匀地散布在两张滤纸条上；在培养基中心接种含有不同来源的单一共生真菌纯培养物的琼脂块，同时设置不接菌的对照处理组，每个处理10个重复，用封口膜密封后置于人工气候箱中培养；

(8)每周观察1次不同处理的种子，记录种子萌发数量及萌发时间，对种子萌发和原球茎发育情况进行分级，记录每一阶段内种子或原球茎的数量，通过和不接菌处理组的对比，筛选出兜唇石斛种子萌发的有效共生真菌。

上述步骤中，所述的种子袋采用网孔为45μm的尼龙网布。这样的网孔大小既可以保持种子不掉出，又可以使水和真菌的菌丝自由穿过，热封机封口时应避免损伤种子。

步骤(3)中所述的种子袋放置点为同时有兜唇石斛成年植株和自然更新的幼苗处。

步骤(4)回收后的种子袋用自来水轻轻冲洗掉附着物及泥土，将清洗后的种子袋放在两层面巾纸中间，轻轻按压使面巾纸吸干种子袋多余的水分，用剪刀小心的剪开封口，打开种子袋放在解剖镜下观察种子萌发情况。