[发明专利]霍山石斛微卫星DNA分子标记

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种霍山石斛微卫星分子遗传标记。

背景技术

微卫星(Microsatellite)又称作短串连重复(Short Tandem Repeats，STRs)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSRs)、简单序列长度多态性(SSLP)。是指一类遍布于生物基因组中的由几个核苷酸对(称为核心序列，一般为1～6bps)为重复单位组成的简单串联重复。其重复次数在同一物种不同的遗传型间是高度可变的，但这段重复的两端却是相对保守的单拷贝序列，据此设计引物，即可通过PCR技术分析核心序列重复次数的变异，在不同的遗传型间检测到多态。根据重复单元的构成，微卫星DNA序列被分为3种类型：单一型(pure)，复合型(compound)和间断型(interrupted)。例如：

单一型：ATATATATATATATATATATATAT

复合型：ATATATCACACACACACACAC

间断型：ATATATCA ATATATCA ATATATA

作为一种分子标记，微卫星DNA具有以下特点：广泛分布于真核生物的基因组中，据估计每6kb长度中就有1个微卫星位点；核心序列的重复次数在个体间呈高度变异性，多态性信息容量高：呈共显性，遵循盂德尔法则遗传；选择中性等等。

基于以上特点，微卫星DNA被广泛用于植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定和种质保存、数量性状基因的分析、辅助育种、构建指纹图谱、遗传多样性及物种进化与亲缘关系等方面的研究。

霍山石斛(Dendrobium huoshanense.C.Z.Tang et S.J.Cheng)又名米斛，兰科石斛属植物，原产安徽霍山，是药用石斛中的极品，并被誉为“中华仙草之最”。作为濒危植物，霍山石斛现己被中国列入国家一级重点保护植物。

由于石斛是一种附生植物，对生态环境要求比较严格，自然繁殖频率极低(＜5％)，加上长期采集，野生植株已濒临灭绝。霍山石斛因其质量上乘而驰名中外，多年来市场上霍山石斛有名无实，有价无市，资源接近枯竭。现在国内外市场上，凡冠以“霍山石斛”、“霍斗”或“野生金霍斛”等名称的一些枫斗产品，均非用真正的霍山石斛加工而成，多数是铜皮石斛、铁皮石斛、扁黄草石斛和钩状石斛的仿冒品。

发明内容

本发明解决的技术问题：分离克隆霍山石斛的微卫星DNA分子标记，建立霍山石斛微卫星DNA技术体系并用这些分子标记进行霍山石斛遗传多样性，石斛属植物遗传关系的研究，以及进行霍山石斛种质鉴定。

本发明解决技术问题的技术方案：霍山石斛微卫星DNA分子标记，包括霍山石斛微卫星(CT)n富集文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到51个含有微卫星重复序列的克隆。得到11个多态性高的微卫星分子标记Hs39、Hs40、Hs41、Hs42、Hs44、Hs47、Hs48、Hs50、Hs54、Hs56、Hs57；Hs39为600个核苷酸，Hs40为694个核苷酸，Hs41为503个核苷酸，Hs42为638个核苷酸，Hs44为437个核苷酸，Hs47为704个核苷酸，Hs48为558个核苷酸，Hs50为540个核苷酸，Hs54为458个核苷酸，Hs56为509个核苷酸，Hs57为541个核苷酸。

附图说明

图1：Hs39位点的特异性引物扩增24个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。

图2：Hs40位点的特异性引物扩增20个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。

图3：Hs41位点的特异性引物扩增25个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。

图4：Hs42位点的特异性引物扩增28个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。

图5：Hs44位点的特异性引物扩增24个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。

图6：Hs47位点的特异性引物扩增24个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。

图7：Hs48位点的特异性引物扩增24个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。

图8：Hs50位点的特异性引物扩增31个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。

图9：Hs54位点的特异性引物扩增29个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。

图10：Hs56位点的特异性引物扩增24个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。