[发明专利]大肠杆菌工程菌及其生产软骨素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及高产软骨素的基因工程菌及其构建方法，属于基因工程领域。涉及生产软骨素的方法，属于发酵工程领域。

背景技术

软骨素(Chondroitin，Ch)是未硫酸化的硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)，是由葡糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1，3键和β-1，4键交替连接而成的多糖。可在其活性位点硫酸化形成硫酸软骨素。目前，硫酸软骨素的工业化生产是以动物软骨为原料，通过提取法生产硫酸软骨素。然而，由于原料来源有限(动物软骨的生产周期较长)、产业水平不高(工艺繁琐、收率不高、质量不稳)、产品质量不高(采用γ射线杀菌导致辐射残留)、污染严重(产生大量的有机物和蛋白废水)等产业瓶颈，严重制约了硫酸软骨素提取产业的发展。目前已经研究了利用微生物发酵法生产硫酸软骨素。

已知某些微生物能合成硫酸软骨素类似物作为其荚膜多糖。如，1996年Manzoni首次报道以E.coli K4为生产菌株，进行发酵生产果糖软骨素，而USP 6777398 B2公开了利用K4荚膜多糖制备硫酸软骨素的方法。此外，WO 0102597，USP 20100151532A1，WO 2010136435A1公开了大肠杆菌K4发酵生产软骨素的发酵工艺。同时近几年对大肠杆菌荚膜多糖的合成途径，以及SlyA蛋白等转录调控因子的转录调控机制有了进一步的研究(Advanced in Applied Microbiology，2008，65：1-26；Journal ofBiological Chemistry，2007，282(46)：33326-33335)。但由于微生物自身代谢的经济学本能和工业生产环境与自然环境的巨大差异，导致软骨素的产量、产率和生产强度较低，成为制约发酵法生产硫酸软骨素工业化的关键瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产软骨素的大肠杆菌工程菌，以及应用该工程菌生产软骨素的方法。

本发明的发明人对大肠杆菌K4荚膜多糖合成途径的调控机制进行了深入的研究，发现SlyA蛋白是荚膜多糖合成途径的正调控因子，其过量表达能增强荚膜多糖合成基因簇启动子的转录活性，高效合成荚膜多糖，因此完成了本发明。

本发明的目的1是提供导入了编码SlyA蛋白的基因工程序列并且具有高效生产软骨素的能力的大肠杆菌工程菌。

在本文中，所述的编码SlyA蛋白的基因工程序列优选为编码选自由以下(A)和(B)所组成的组的DNA：

(A)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；和

(B)包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的同一性在90％以上，并编码具有SlyA蛋白转录调控活性的蛋白的DNA。

所述的SlyA蛋白选自由以下(a)和(b)所组成的组的蛋白质：

(a)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质；以及

(b)包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列的的同一性在95％以上，并具有SlyA蛋白转录调控活性。

所述编码SlyA蛋白的基因工程序列优选来源于为大肠杆菌K4，包括ATCC 23502(American Type Culture Collection-USA)，Bi 8337/41(International Escherichia Centre-Denmark)，NCTC 9005(Nationa Collection of Type Cultures-UK)，U 1-412616(Freiburg collection)。

本发明的目的2是提供生产软骨素的方法，其至少包括以下步骤

(1)培养如上所述的大肠杆菌工程菌；

(2)从该培养物中收集荚膜多糖；

(3)将收集到的荚膜多糖进行脱果糖处理，得到软骨素。

本发明的目的3是提供包含插入编码slyA蛋白的基因工程序列的表达载体。

附图说明

图1是表达SlyA基因的重组载体的结构图。

图2是重组载体的酶切图谱。泳道1为Bam HI和Hind III双酶切为441 bp和4414 bp两条带，泳道2和3为重组质粒，M为分子量标记。

图3是SlyA的表达图谱。泳道1为未加IPTG诱导的大肠杆菌工程菌，泳道2为加入IPTG诱导的大肠杆菌重组菌，泳道3为导入pTrcHisA的大肠杆菌，泳道4为大肠杆菌K4原菌，M为分子量标记。