[发明专利]一种同时鉴别食品中四种肉类成分的多重PCR方法无效

专利信息
申请号: 201210099651.1 申请日: 2012-03-31
公开(公告)号: CN102605090A 公开(公告)日: 2012-07-25
发明(设计)人: 张驰;杨军;周骏贵;何玮玲 申请(专利权)人: 南京市产品质量监督检验院
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68
代理公司: 南京知识律师事务所 32207 代理人: 胡锡瑜
地址: 210028 江*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 一种 同时 鉴别 食品 中四种 肉类 成分 多重 pcr 方法
【说明书】:

一.技术领域

发明属于食品质量安全检测技术领域,具体涉及应用通用引物多重PCR法对食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分的同时快速检测方法及其应用。

二.背景技术

肉和肉制品掺杂掺假是我国食品质量控制面临的重要挑战之一。不法企业在利益的驱使下使用相对廉价的猪肉、鸡肉等肉类原料,冒充牛肉、羊肉制品进行销售,严重侵犯了消费者的合法权益。“牛肉膏”事件的曝光使得肉类掺假进一步成为公众关注的焦点。传统的依靠感官与经验的肉类形态学鉴别手段已远不能满足对肉制品掺假现象进行控制与监管的需要,因此,对于我国肉制品市场占有率较高的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉,建立科学、准确快速高通量筛选方法已十分必要。

以聚合酶链反应(PCR)为基础的技术已逐步成为了食品中肉类种属鉴定的核心方法。许多学者根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物,利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增,继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。近年来,实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度,并使得肉类含量的定量溯源成为可能。在目标基因选择方面,动物线粒体基因组DNA序列具有高度的物种特异性,且由于拷贝数多而在食品加工过程不完全降解,因此其多态性位点是设计肉类成分定性检测的首选靶点。目前,根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物,所建立的PCR与实时荧光PCR方法已见大量报道,且进入了国内权威的检测技术标准。

在实际检测中,尤其需要对大量的食品样本进行肉类掺假的筛选时,提高检测效率与通量对于及时监管十分重要。以多重PCR为基础,建立多种肉类成分同时鉴别的快速检测技术是提高效率的有效途径之一。然而目前,针对我国肉类掺假现状,应用多重PCR的肉类快速同时鉴别与筛选技术尚未见报道。

三.发明内容

本发明需要解决的问题是:根据动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点,利用正向引物共用、反向引物特异的策略,建立用于猪、牛、羊、鸡4种肉类DNA快速检测的通用引物多重PCR体系,通过电泳检测扩增产物分子量大小对物种加以鉴别,可在同一反应体系中实现4种肉类成分的同时检测。首先,通过对多种常用动物基因组DNA提取方法的比较选择高效稳定的肉制品中总DNA提取方法;然后,基于动物线粒体细胞色素b基因的特异性位点,设计多重PCR引物;接着,进行多重PCR检测方法优化及特异性、灵敏度考察;最后,应用此方法对80份食品盲样进行检测以验证其实用价值。

本发明中,基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点,设计5条长度不同的通用引物多重PCR引物,其中鸡、牛、羊、猪的产物片段分别为216bp、263bp、320bp和387bp,建立并优化多重PCR反应体系,通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别。

本发明的技术方案包括:1.分别使用DNeasy组织细胞DNA提取试剂盒、SDS-蛋白酶K法及CTAB-蛋白酶K法提取生鲜的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中的总DNA,产物测定于260nm和280nm处的吸光度值,计算DNA浓度和纯度,比较提取效率和纯度,确定提取肉类中总DNA的方法。2.设计并合成多重PCR的引物。3.多重PCR检测反应条件及优化。4.针对提取的动物基因组总DNA进行多重PCR检测,考察方法的特异性与灵敏度。5.对大量食品样品进行盲样检测。

1.分别使用DNeasy试剂盒、经典的SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法提取猪、牛、羊、鸡4种肉类的总DNA。表1列出了应用3种方法对生鲜肉提取的结果。SDS-蛋白酶K法与DNeasy试剂盒法所提取的DNA浓度处于同一个数量级,SDS-蛋白酶K法在浓度与纯度方面均略优。CTAB-蛋白酶K法由于对肌肉组织消化效果较差,因此DNA提取效率显著偏低。相比于SDS-蛋白酶K法,DNeasy试剂盒大大节省了提取时间,且无需使用苯酚、氯仿等有毒试剂,综合考虑提取速度与效率,后续实验中均采用DNeasy试剂盒提取食品中的总DNA。

表1  3种DNA提取方法的比较

Table 1 Comparison of three DNA extraction methods

数据(平均数±SE)代表6次重复。Data(average±SE)represents six repeats

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