[发明专利]一种检测呋喃妥因代谢物的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测呋喃妥因代谢物的试剂盒及方法，具体涉及一种用于检测呋喃妥因代谢物的胶体金试纸条，其特别适于动物组织中呋喃妥因代谢物残留的检测。

技术背景

呋喃妥因，属于硝基呋喃类药物，是一种人工合成的抗菌药，常作为广谱类抗生素用于预防和治疗由沙门氏菌和埃希氏菌引起的猪、牛、家禽及蜜蜂的胃肠道疾病。但近年来的研究表明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有很大的毒性，有致畸胎副作用，且能诱发癌症，因而引起了人们的高度重视，多国已禁止了此类药物在治疗和饲料中的使用。

由于硝基呋喃类药物的热和化学不稳定性，常以检测其代谢产物作为残留标示物。目前用来检测呋喃妥因代谢物的最常用方法是高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS、LC-MS/MS)等，这些方法虽然具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点，但仍存在一定缺点，如样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，已逐渐不能满足发达国家及食品加工企业对检测方法检测限的要求。与之相比，免疫学测定方法灵敏度较高、特异性强、试样预处理简单、分析时间短，适合现场监控和大量样本的筛查，能够更好地满足我国养殖户、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测呋喃妥因代谢物的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒包括微孔试剂和试纸，微孔试剂具有微孔塞，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂中冻干有呋喃妥因代谢物特异性抗体-胶体金标记物；呋喃妥因代谢物特异性抗体可为呋喃妥因代谢物单克隆抗体或呋喃妥因代谢物多克隆抗体；反应膜上包括检测区和质控区；当呋喃妥因代谢物特异性抗体为呋喃妥因代谢物单克隆抗体时，检测区包被呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗鼠抗抗体；当呋喃妥因代谢物特异性抗体为呋喃妥因代谢物多克隆抗体时，检测区包被呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗兔抗抗体。

所述呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物是由呋喃妥因代谢物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述呋喃唑酮代谢物半抗原是由呋喃妥因代谢物与对苯二甲醛反应得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述呋喃妥因代谢物特异性抗体-胶体金标记物中的呋喃妥因代谢物特异性抗体是以呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

所述样品吸收垫上粘贴有保护膜，为检测端，上面有MAX标记线。

所述检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试剂盒的方法，其包括步骤：

1)制备冻干有呋喃妥因代谢物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有呋喃妥因代谢物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试剂盒。

具体地说，步骤包括：

1)将呋喃妥因代谢物与对苯二甲醛反应，制备呋喃妥因代谢物半抗原；

2)将呋喃妥因代谢物半抗原与载体蛋白偶联，制备呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物；

3)用呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌呋喃妥因代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株或用呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物免疫兔，得到呋喃妥因代谢物多克隆抗体；

4)提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体；

5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6)将制备的呋喃妥因代谢物特异性抗体加入到制备的胶体金中，得到呋喃妥因代谢物特异性抗体-胶体金标记物；

7)将呋喃妥因代谢物特异性抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；

8)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积百分含量)、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；