[发明专利]一种改进的CLIP法鉴定RNA结合蛋白的靶标RNA的方法

权利要求书

1.微球菌核酸酶在紫外交联-免疫共沉淀技术中的应用。

2.一种紫外交联-免疫共沉淀获取RNA结合蛋白的靶标RNA方法，其包括使用微球菌核酸酶对紫外交联后的靶标RNA作不完全酶解。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其还包括在酶解后使用能去除Ca²⁺离子的螯合剂使该酶失活。

4.一种对紫外交联-免疫共沉淀获取的RNA结合蛋白的靶标RNA进行cDNA合成的方法，其包括对根据权利要求2或3所获得的靶标RNA 5’末端磷酸化并连接5’RNA接头，之后对连接产物去磷酸化、分离和回收，之后连接3’RNA接头，并进行RT-PCR扩增，获得靶标RNA相应的cDNA文库。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：将样品经紫外交联后用微球菌核酸酶对靶标RNA作不完全酶解，酶解后使用能去除Ca²⁺离子的螯合剂使该酶失活，对靶标RNA 5’末端进行磷酸化并加上5’RNA接头，去磷酸化后进行SDS-PAGE分离，转膜，回收连接有5’ RNA接头的游离靶标RNA，连接3’ RNA接头，并进行RT-PCR扩增获得cDNA文库。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述不完全酶解是将靶标RNA酶解至30－60nt 之间。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述5’ RNA接头的5’端连接有封闭保护基团。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述3’ RNA接头的3’端连接有封闭保护基团。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述5’ RNA接头的5’端连接有生物素封闭保护。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述3’ RNA接头的3’端连接有嘌呤霉素封闭保护。

11.一种鉴定RNA结合蛋白的靶标RNA的方法，其包括按照权利要求5~10任一项所述的方法进行cDNA合成，获得靶标RNA相应的cDNA文库，并对cDNA文库进行高通量测序，并根据测序结果进行基因定位。