[发明专利]胸腺素β4四联体基因及其在大肠杆菌中表达的方法

权利要求书

1.一种4×Tβ4基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，包括目的基因和载体，其特征在于，所述目的基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述载体选自质粒、粘粒或λ噬菌体中的一种。

4.一种在大肠杆菌中表达4×Tβ4功能蛋白的方法，其特征在于，该方法包括如下的步骤：

步骤一，将含有权利要求1所述4×Tβ4基因的克隆载体质粒进行酶切，回收所述4×Tβ4基因的DNA片段，获得带有相应粘性末端的所述4×Tβ4基因，然后将所述带有相应粘性末端的4×Tβ4基因克隆到原核表达载体中，通过测序或酶切鉴定确保所述表达载体中的所述4×Tβ4基因阅读框架正确；

步骤二，将所述表达载体用热激法转化大肠杆菌中，获得包含所述4×Tβ4基因表达载体的大肠杆菌工程菌；

步骤三，提取4×Tβ4功能蛋白。

5.根据权利要求4所述的在大肠杆菌中表达4×Tβ4功能蛋白的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述转化包括以下步骤：

步骤1，取刚刚用CaCl₂法制备的感受态细胞，或从-70℃冰箱中取出用CaCl₂法制备的感受态细胞于冰上融化10min；

步骤2，无菌条件下按照每200μL菌液加入100ng已纯化的表达载体DNA，将5～10μL所述表达载体加入所述感受态细胞中，用加样器轻轻混匀，放置冰上30min；

步骤3，42℃热激90s，再放于冰上1～2min；

步骤4，加入800μL经过37℃预热的含有卡那霉素100mg/L的LB液体培养基，37℃，180rpm复苏培养90min；

步骤5，5000rpm离心5min，吸去上清900μL，将剩余的100μL菌液混匀；

步骤6，用涂布棒将所述菌液均匀涂于含有100mg/L的卡那霉素的LB固体平板上，37℃倒置16h～24h至长出菌落，用无菌牙签从所述LB固体平板上挑取抗性菌落进行鉴定。

6.根据权利要求5所述的在大肠杆菌中表达4×Tβ4功能蛋白的方法，其特征在于，所述LB液体培养基的组分以及各组分的质量百分比为：酵母提取物为0.5％，胰蛋白胨为1％，氯化钠为1％，余量为蒸馏水，该LB液体培养基的pH值为7.0。

7.根据权利要求5所述的在大肠杆菌中表达4×Tβ4功能蛋白的方法，其特征在于，所述LB固体培养基的组分以及各组分的质量百分比为：酵母提取物为0.5％，胰蛋白胨为1％，氯化钠为1％，琼脂粉1.5％，卡那霉素为0.01％，余量为蒸馏水，该LB固体培养基的pH值为7.0。

8.根据权利要求4所述的在肠杆菌中表达4×Tβ4功能蛋白的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述提取包括以下步骤：

4℃条件下，12000rpm离心5min收集经诱导表达所述4×Tβ4蛋白的菌体，弃上清，所述菌体一直保持在冰上；

按5∶1的比例用PBS溶解所述离心收集的菌体，超声波破碎所述菌体，样品一直保持在冰上，所述PBS的组分以及各组分浓度为：140mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄；

重悬菌体沉淀，室温搅拌15～60min，或者轻轻振荡，至重悬溶液呈半透明状；

4℃条件下，10000g离心30min，弃掉沉淀，收集上清液用于上柱纯化；

悬浮于50％Ni-NTA溶液，装柱，所述Ni-NTA用量为5-10mg蛋白/mL树脂；

所述树脂自然沉降后，用5倍柱体积的ddH₂O过柱清洗层析柱，再加入5-10倍柱体积的1×Ni-NTA buffer B平衡所述层析柱；

样品上柱，用5-10倍柱体积的1×Ni-NTA buffer B洗柱，流速为1mL/min，收集流出液，进行SDS-PAGE检测；

用5～10倍柱体积的1×Ni-NTA buffer C洗柱，收集流出液，进行SDS-PAGE检测；

用5倍柱体积的1×Ni-NTAbufferE洗柱，对4×Tβ4蛋白进行洗脱，分别用2mL的EP管收集洗脱液，所述洗脱液保存于-20℃。