[发明专利]分子miR-150在筛选制备检测大肠癌药物中的应用

权利要求书

1.分子miR-150在筛选制备检测大肠癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分子miR-150通过下列方法得到：

I、总RNA的提取

(1)碾碎大肠正常组织、腺瘤或腺癌组织中加入1ml TRIzol，在旋涡震荡器上混匀；

(2)加入1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1分钟，室温25℃下静置5分钟；

(3)4℃，12,000rpm离心15分钟后，将上清液转入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5分钟；

(4)4℃，12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀15分钟；

(5)去上清，沉淀室温25℃晾干后，加入无核糖核酸酶试剂的水充分溶解沉淀，测定A260和A280值；1.2总RNA的纯化与质检；

II、纯化总RNA

(1)取RNA 70ug用无核糖核酸酶试剂的水调整到100μL，上核糖核酸酶微型离心柱；

(2)加入350uL Buffer RLT，1mL Buffer RLT中先加入10μL丙酮)，充分混匀；

(3)加入250μL无水乙醇，充分混匀；

(4)将混和液加到核糖核酸酶微型离心柱中，大于8,000rpm离心15s；

(5)弃滤液，加入500uL Buffer RPE，第一次使用之前加入无水乙醇，无水乙醇∶Buffer RPE＝1∶4，大于8,000rpm离心15s；

(6)弃滤液，加入500uL Buffer RPE，大于8,000rpm离心2min；

(7)将RNeasy mini spin column移入一个新的收集管，最大转速16,000rpm离心1min；

(8)将核糖核酸酶微型离心柱中的液体加入一个EP管中，在膜中间小心加入30μL无核糖核酸酶试剂的水，室温放置1min；

(9)最大转速16,000rpm，离心1min，得到总RNA；

III、芯片筛选miR-150：利用微阵列实验，2-5ug总RNA样品通过YM-100微离心过滤柱分离得到小RNA＜300nt；使用聚合酶在分离到的小RNA 3’端加上poly A尾巴，再将1个寡聚核苷酸标记与这个polyA尾巴连接用于后续的荧光标记；在双样品实验中，用两个不同的标记物来标记两个RNA样品；杂交反应利用微循环泵的循环作用在微流体芯片上过夜进行杂交反应，在微流体芯片上，每条检测探针都是由一个化学修饰核苷酸编码段互补或是与其他RNA互补和一个由聚乙二醇组成的间隔段组成，检测探针均使用PGR显像试剂化学法进行原位合成；杂交解链温度是通过化学修饰的检测探针进行平衡，杂交使用含有25％甲酰胺的100μL 6xSSPE缓冲液0.90M NaCl，60mM Na2HPO4，6mM EDTA，pH 6.8，杂交温度为34℃，杂交后检测使用标记特异性的Cy3和Cy5荧光染料，利用激光扫描仪采集杂交图像并使用Array-Pro图像分析软件进行图像数字化转换，从中筛选出差异最为明显的miR-150。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为筛选对分子miR-150敏感的化合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为将对分子miR-150敏感的化合物用于制备检测大肠癌的药物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为由对分子miR-150敏感的化合物作为活性成分与药用载体组成的检测大肠癌的试剂盒。