[发明专利]一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种显微成像技术，特别涉及一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法。

背景技术

共焦显微技术最初的主要目的是消除普通光学显微镜在探测样品时产生的多种散射光。激光扫描共聚焦显微镜是一种先进的分子生物学和细胞生物学研究仪器。它在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，结合数据化图像处理技术，采集组织和细胞内荧光标记图像，在亚细胞水平观察钙等离子水平的变化，并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系。

激光扫描共聚焦显微镜对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好的会聚，可以全部通过针孔被探测器接收。而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。而且随着距离物镜焦平面的距离越大，样品所产生的杂散光在针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少，因而在探测器上产生的信号就越小，影响也越小。由于它的应用范围较广泛，已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学和药理学等研究领域中很重要的研究技术。

共焦显微镜从产生至今获得了巨大的发展，扫描方式从最初的狭缝扫描方式（扫描速度较快，图像分辨率不高），到阶梯式扫描技术（提高了图像分辨率，标本制备要求太高），再到驱动式光束扫描器（扫描速度较快，符合共聚焦原理），又出现使用光子晶体光纤产生的超白光作激励光源的彩色共焦显微镜、三维数字共焦拉曼显微镜以及光纤耦合多路复用共焦显微镜等新型共焦显微镜。频分复用荧光共焦显微成像的概念和构想诞生于2006年，当时只能通过马赫曾德光路和机械斩波器实现双路频分复用荧光共焦系统，系统的体积很大。为了真正实现多路频分复用系统，发明人曾提出采用离轴全息透镜阵列实现多路频分复用荧光共焦成像系统，但是由于离轴系统对角度要求很高，造成了系统实现的麻烦。为此，我们又提出了采用同轴电控变焦聚合物分散液晶的多通道频分复用荧光共焦实现方法。该系统的关键器件是同轴液晶透镜，具有集成式设计，易于操作，通过面型和电场调控实现共焦和离焦控制。这样使得频分复用荧光共焦的概念具体的实现成为容易操作，易于实现的系统，同时该系统具有体积小，无运动部件等优点。

发明内容

本发明是针对现有传统的共焦显微镜和离轴多路频分复用荧光共焦显微系统存在的问题，提出了一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，系统采用N×N式透镜阵列来实现斩波，能够实现多点荧光信号的并行实时高速探测，并且具有高的空间分辨率和时间分辨率等特点。

本发明的技术方案为：一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，具体包括如下步骤：

1）搭建N×N通道多频调制激光光路：将激光器、扩束镜、同轴H-PDLC透镜阵列、滤波板、透镜同轴依次搭建，并与平台始终保持水平， 30mw准直半导体激光器发出的波长为405nm的光束耦合进扩束镜，扩束镜出射的光束到达N×N式同轴H-PDLC透镜阵列上进行分光和不同频率的斩波调制，使得通过N×N式同轴H-PDLC透镜阵列上的液晶盒阵列的激光的焦点处在滤波板上的小孔位置；

2）搭建N×N路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发光路：通过焦平面也在同轴H-PDLC透镜阵列的焦平面F的透镜，将经H-PDLC透镜阵列出射的聚焦的N×N束光调整为平行光束射出，耦合进入二向色镜组中，经二向色镜组激发的405nm的激光将耦合射入到放大倍率为40倍、数值孔径为0.65的无限远油浸显微物镜，将生物样品摆放于三维调整架之上，调整三维调整架使生物样品恰好处于显微物镜焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品上聚焦为n²个光点，激发出荧光；

3）搭建n²路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像：由生物样品表面激发的520nm-540nm绿色荧光在样品与显微物镜相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜，成为平行光束，入射到二向色镜组上，荧光全部从二向色镜组透射出去，透射出的荧光入射分光棱镜进行第二次分光，分成两部分，其中一部分由消色差透镜会聚聚到 CCD摄像机由CCD采集样品的信号最后在计算机中软件中得到样品细胞图像，另一部分荧光经一透镜由光纤耦合器阵列耦合并通过光纤输送到光电倍增管PMT中，该信号属于共焦扫描显微信号；