[发明专利]一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于筛选药物领域，特别涉及一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法。

背景技术

细胞外基质的降解是肿瘤细胞迁移、浸润基质的前提，也是瘤细胞与基质黏附以后发生的重大变化。金属基质蛋白酶(MMP)是调节细胞外基质动态平衡最重要的酶系。所以MMP是治疗癌症及肿瘤的重要靶点。但是现有体外的金属基质蛋白酶抑制剂的筛选方法不能模拟MMP在体内的作用方式，很多研究证明可溶性的MMP(比如：-1.-13，-2，-9)不能介导肿瘤细胞的侵袭能力。

1992年Gossen等成功地利用原核基因调控元件构建了四环素(tetracycline，Tet)真核细胞基因调控表达系统，它利用Tet及其衍生物对所感兴趣的基因进行诱导表达。随着人们对该系统的不断改进，使这种诱导表达具有严密、高效、可控性强、表达泄露小等优点。目前真核细胞可诱导的基因表达系统已被广泛应用于基因功能研究及基因治疗研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法，该方法建立了一个基于Retro-X Tet-Off表达系统的筛选MMP抑制剂的方法，该方法在体外最大程度模拟了MMP的作用环境，从而对候选药物对MMP的作用做出更准确的评估。

本发明的一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法，包括：

(1)设计引物，PCR完成扩增金属基质蛋白酶的全长cDNA；

(2)将上述扩增的cDNA插入pRetroX-Tight-Pur的多克隆位点，构建以Retro-X Tet-Off为载体的表达体系；

(3)将上述构建完成的载体对细胞系进行转染，并筛选阳性克隆，当细胞铺满皿底后，将培养基换成不含DOX的培养基，诱导MMP的表达；

(4)设空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和不同药物浓度处理组，用细胞膜探针对细胞膜进行染色观察，利用对细胞形态学的分析评估候选待评价药物对MMP的作用。

所述步骤(1)中的引物为上游引物：TGAGGATCCATGCATCCAGGGTCCTGGC；下游引物：AGCTCGCGACTTAACACCACAAAATGG。

所述步骤(3)中的细胞系为PCS-100-011细胞系，人的大动脉原代细胞，体外培养的内皮细胞可以分泌大量细胞外基质，可以形成一个类似与体内细胞及基质的环境。

所述步骤(4)中的细胞膜探针为DiI细胞膜探针，在荧光显微镜下可更方便的观察分析。

本发明利用Retro-X Tet-Off表达系统在细胞表达，并发生作用，从而引起细胞形态变化，以细胞形态的变化作为筛选金属基质蛋白酶的标志，培养过程中加入四环素抑制金属基质蛋白酶的表达，使细胞正常贴壁生长，呈正常的细胞形态。等细胞贴壁后，换成不含四环素的培养基，诱导金属基质蛋白酶的表达，使细胞发生形态变化。细胞水平筛选抑制剂，细胞表达的蛋白酶的作用方式更加接近体内。

有益效果

本发明建立了一个基于Retro-X Tet-Off表达系统的，能最大程度模拟MMP在体内的作用的方法，可用于MMP抑制剂的筛选，能对蛋白酶抑制剂有更准确的判断，细胞形态作为筛选标志更为直观和灵敏，利用细胞膜荧光探针，使检测更为方便快速，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

实施例以MMP-13为例，但是本专利不仅限于MMP-13，也可用于其他金属基质蛋白酶。本实施例采用Clontech公司Retro-X Tet-Off Advanced Inducible Expression System，包含：pRetroX Tet-Off质粒，pRetroX-Tight-Pur质粒以及pRetroX-Tight-Pur-luc对照质粒。采用GP293细胞为包装细胞。采用PCS-100-011作为靶细胞。

(1)MMP-13表达质粒的构建：