[发明专利]一种检测转基因水稻克螟稻2号的质粒标准分子及构建

说明书

技术领域：

本发明涉及一种转基因检测用质粒，具体涉及一种用于检测转基因水稻克螟稻2号的质粒标准分子及其构建方法。

背景技术：

克螟稻2号(KMD2)是我国培育的一种转基因水稻。目前，转基因植物标准物质的研制和应用成为国内外农业转基因生物安全管理体系建设的当务之急，也成为制约转基因植物检测技术发展和检测机构建设的瓶颈问题之一。

质粒标准分子以其制备快捷，成本经济，易于复制等优点被称转基因检测用的“金标准”。目前已有多种转基因植物检测用质粒标准分子，但是针对转基因水稻克螟稻2号进行定量检测尚无报道。因此，构建用于对克螟稻2号进行特异性定量检测的质粒标准分子非常急需。

发明内容：

本发明的目的是构建一个用于转基因水稻克螟稻2号特异性定量检测的质粒标准分子，作为阳性标准品，可用于转基因定量检测和安全评价、实验室质量控制等领域。

本发明首次发现SEQ ID NO：2所示序列的基因可作为克螟稻2号水稻内标准基因，并协同转基因水稻克螟稻2号的构建特异性序列SEQ ID NO：1共同构建于质粒分子pEASY-T3。

本发明经过特异性验证和可替代性研究，结果证明上述构建的质粒标准分子针对转基因水稻克螟稻2号具有检测特异性，并且该质粒分子可以替代阳性克螟稻2号基因组作为阳性标准品。

本发明的定值结果通过以下两种方法确定：

一是核酸序列的测序得到的认定值，测序表明所述质粒分子中两个基因片段均以单拷贝形式连入，认定值为两个片段的比值，即为1，不确定度可忽略；

二是通过实时荧光定量PCR的方法计算Ct比值为参考值，结果为1.032。经不确定度评价，该质粒分子标准物质的扩展不确定度为0.032。

以上所得的认定值和参考值表明，本发明提供的质粒标准分子适合作为转基因水稻克螟稻2号定量检测。

附图说明：

图1是内标准基因和外源基因片段从基因组DNA扩增获得的片段的电泳图，其中106bp代表内标准基因片段，174bp代表转化体构建特异性片段；

图2是水稻克螟稻2号特异性定量检测用质粒构建物理图，图中内标基因(En表示)和KMD2标记分别表示内标准基因片段和外源特异性检测片段；

图3是转基因水稻克螟稻2号质粒标准分子特异性验证的电泳图，其中，M为DNA Ladder，1克螟稻2号；2科丰6号；3华恢1号；4LLRICE62；5空白；

具体实施方式：

实施例1标准分子构建

1、目标基因序列查找及引物设计

通过查阅转化体的相关资料，选取克螟稻2号构建特异性(外源基因)序列片段，长174bp(SEQ ID NO：1)，为单拷贝；选取单拷贝内标准基因片段，长106bp(SEQ ID NO：2)，作为内标准基因。

本实验共需要两对引物和相应的探针，由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，序列见SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8。

表1外源基因和内标准基因的引物及探针序列

注：表中FAM为探针的发光基团，ECLIPSE和MGBNFQ为探针的淬灭基团

2、目标DNA片段的扩增及标准分子构建

转基因水稻克螟稻2号基因组DNA采用Wizard Magnetic DNA Purification System for Food FF3750(Promega公司)按照说明书提取。随后根据表1引物，分别以克螟稻2号的基因组DNA为模板，对转化体特异性序列和内标准基因片段进行PCR扩增，对扩增得到的条带进行回收纯化，用琼脂糖凝胶电泳验证，见图1。

将回收得到的SEQ ID NO：1片段和SEQ ID NO：2片段同过重叠PCR技术融合后，连入pEASY-T3载体的T位点，即得到质粒标准分子，物理图谱见图2。

3、质粒标准分子的纯化

构建得到的质粒转化入大肠杆菌受体菌中，菌种保藏在-70℃冰箱，以载体氨苄青霉素AMP抗性为筛选标记。质粒的大量制备由保藏的菌种开始，首先使菌种复壮，划平板挑取单克隆菌落在LB培养液中进行大量培养，然后采用质粒提取试剂盒PureYield^TM Plasmid Midiprep System(Promega公司)进行提取和纯化。