[发明专利]转基因水稻华恢1号特异性定量检测用质粒标准分子

说明书

技术领域：

本发明涉及一种转基因生物检测用质粒，具体涉及转基因水稻华恢1号特异性定量检测用质粒标准分子。

背景技术：

在转基因生物安全管理体系建设中，转基因安全监管问题是当务之急。其中，转基因生物的特异性定量检测是转基因生物安全管理中重要的工作。

在转基因生物的检测中，质粒标准分子以其制备快捷，成本经济，易于复制等优点被称转基因检测用的“金标准”。目前已有多种转基因植物检测用质粒标准分子，如文献：转基因玉米pNK603质粒分子的构建与应用；转基因玉米pUC57-BT11质粒标准分子的构建与适用性研究；转基因作物筛查用阳性质粒分子的构建及应用研究；Development of One Novel Multiple-Target Plasmid for Duplex Quantitative PCR Analysis of Roundup Ready Soybean；Event-Specific Quantitative Detection of Nine Genetically Modified Maizes Using One Novel Standard Reference Molecule；转豇豆胰蛋白酶CPTI基因棉花检测用标准分子的制备。

农业部于2009年8月发放了“华恢1号”在湖北省的生产应用安全证书。这意味着转基因水稻，朝着水稻原产国和水稻消费大国——中国的商业化生产大门迈出了实质性一步。以上文献虽然均报道了某些转基因玉米、棉花、大豆、水稻和棉花等检测用质粒分子的相关内容，但是针对转基因水稻华恢1号进行定量检测的标准质粒尚未报道。

因此，构建用于对华恢1号进行特异性定量检测的质粒标准分子非常急需。

发明内容：

本发明的目的是构建一个用于转基因水稻华恢1号特异性定量检测的质粒标准分子，在采用实时荧光定量PCR方法对转基因水稻华恢1号进行特异性定量检测时，用其作为阳性标准品。

本发明首次发现SEQ IDNO：2(106bp)所示序列的基因可作为华恢1号水稻内标准基因，并协同转基因水稻华恢1号的特异性边界序列SEQ ID NO：1(120bp)共同构建于质粒分子pEASY-T3。

本发明经过特异性验证和可替代性研究，结果证明上述构建的质粒标准分子针对转基因水稻华恢1号具有检测特异性，并且该质粒分子可以替代阳性华恢1号基因组作为阳性标准品。

本发明的定值结果通过以下两种方法确定：

一是核酸序列的测序得到的认定值，测序表明所述质粒分子中两个基因片段均以单拷贝形式连入，认定值为两个片段的比值，即为1，不确定度可忽略；

二是通过实时荧光定量PCR的方法计算Ct比值为参考值，结果为0.967。经不确定度评价，该质粒分子标准物质的扩展不确定度为0.024。

以上所得的认定值和参考值表明，本发明提供的质粒标准分子适合作为转基因水稻华恢1号定量检测。

附图说明：

图1是内标准基因和外源基因片段从基因组DNA扩增获得的片段的电泳图，其中106bp代表内标准基因片段，120bp代表5’转化体特异性片段，两个片段分别4个重复扩增；

图2是水稻华恢1号特异性定量检测用质粒构建物理图，图中内标基因(En表示)和BT GENE标记分别表示内标准基因片段和外源特异性检测片段；

图3是转基因水稻华恢1号质粒标准分子特异性验证的电泳图，其中，M为DNALadder，1华恢1号；2科丰6号；3克螟稻2号；4LLRICE62；5空白；

图4是转化体特异性基因标准曲线的替代性结果；图中，横座标是拷贝数的对数，纵座标是实时荧光定量PCR扩增到阈值是的循环次数，即Ct值。

图5是内标准基因标准曲线的替代性结果。图中，横座标是拷贝数的对数，纵座标是实时荧光定量PCR扩增到阈值是的循环次数，即Ct值。

具体实施方式：

实施例1 标准分子构建

1、目标基因序列查找及引物设计

通过查阅转化体的相关资料，选取华恢1号转化体特异性(外源基因)序列片段，长120bp(SEQ ID NO：1)，为单拷贝；选取单拷贝内标准基因片段，长106bp(SEQ ID NO：2)，作为内标准基因。