[发明专利]重组人NADH脱氢酶亚单位4基因及其表达载体构建方法

权利要求书

1.重组人NADH脱氢酶亚单位4基因，其核苷酸序列SEQ ID NO：1所示，其大小为2889bp。

2.如权利要求1所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体的构建方法，其步骤包括：

(一)、含有人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒载体的构建

将权利要求1所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因SEQ ID NO：1加Kpn I和Sal I两个酶切位点或者将以该新基因设计引物用PCR扩增的产物与pSNaV质粒载体，分别进行Kpn I和Sal I双酶切，回收酶切产物，T4DNA Ligase连接过夜，连接产物转化感受态细胞得到重组pSNaV/rAAV2/2-ND4；

(二)、rAAV2/2-ND4重组腺相关病毒包被

1)、转染前一天，将293T细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×107个/mL细胞，培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜；

2)、转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为：

(a)每个转染瓶取pAdHelper、pAAV-r2c5、pSNaV-ND4质粒按要求比例与DMEM+PlasmidTrans II(VGTC)(转染试剂)在1.5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10～15min；

(b)将A试剂同30mL DMEM+10％牛血清混合均匀，编号为B试剂；

(c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％CO₂的培养箱中继续培养；

(d)转染16h后，换完全培养基(DMEM+10％牛血清)；

3)、转染48h后，收取细胞；

4)、将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次；

(二)rAAV2/2-ND4病毒的纯化与浓缩

采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化rAAV2/2-ND4病毒；

(三)rAAV2/2-ND4的目的基因的PCR鉴定

取10uL重组rAAV2/2-ND4载体病毒样品，煮沸5min，冰浴，取1uL作为模板，

所述特异性引物为：

1F：5’-ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3’；

1R：5’-GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3’；

(四)、rAAV2/2-ND4的滴度测定

标记探针点杂交方法检测病毒液中rAAV2/2-ND4的物理滴度。

3.权利要求2的所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体中所构建的重组腺相关病毒载体pSNaV/rAAV2/2-ND4。

4.权利要求2的所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体中所获得的含有pSNaV/rAAV2/2-ND4载体的菌株。

5.权利要求2所述的重组腺相关病毒rAAV2/2-ND4在兔子中的临床应用。